Her beskriver vi protokoller for analyse og visualisering af strukturen og forfatning af hele antistof repertoirer. Dette indebærer erhvervelse af enorme sekvenser af antistof RNA ved hjælp af næste generation sequencing.
Den enorme tilpasningsevne af antigen anerkendelse af antistoffer er grundlaget for den erhvervede immune system. Trods vores forståelse for de molekylære mekanismer bag produktionen af de store repertoire af antistoffer af de erhvervede immunforsvar, har det ikke endnu kunnet nå frem til et samlet overblik over en komplet antistof repertoire. Især har B-celle repertoirer været betragtet som en sort boks på grund af deres astronomiske antal antistof kloner. Dog næste generation sequencing teknologier gør det muligt gennembrud for at øge vores forståelse af B-celle repertoire. I denne rapport beskriver vi en enkel og effektiv metode til at visualisere og analysere hele individuelle mus og humant antistof repertoirer. Fra den immune organer var repræsentativt fra milten i mus og perifert blod mononukleære celler i mennesker, total RNA parat, reverse transskriberet og forstærkes ved hjælp af metoden 5′-RACE. Ved hjælp af en universel fremad primer og antisense primere for antistof klasse-specifikke konstante domæner, var antistof mRNAs ensartet forstærkes i proportioner afspejler deres frekvenser i antistof populationer. Amplikoner blev sekventeret af næste generation sequencing (NGS), giver mere end 105 antistof sekvenser pr. immunologiske prøve. Vi beskriver protokollerne for antistof sekvens analyser herunder V D J-gen-segment annotation, en fugleperspektiv af antistof repertoire, og vores beregningsmetoder.
Antistof-systemet er et af de grundlæggende principper for den erhvervede immune system. Det er yderst potent mod invaderende patogener på grund af sin store mangfoldighed, fine antigen anerkendelse specificitet og den klonal ekspansion af antigen-specifikke B-celler. Repertoire af antistof-producerende celler, B er anslået til at være mere end 1015 i en enkelt individuel1. Denne enorme mangfoldighed er genereret ved hjælp af VDJ gen rekombination i immunoglobulin genetiske loci2. Beskrivelse af hele B celle repertoirer og deres dynamiske ændringer i svar til antigen-vaccination er derfor udfordrende, men afgørende for en fuldstændig forståelse af antistofrespons mod invaderende patogener.
På grund af deres astronomiske mangfoldighed, har B-celle repertoirer været betragtet som en sort boks; dog, fremkomsten af NGS teknologi har aktiveret gennembrud til en øget forståelse af deres kompleksitet3,4. Hele antistof repertoirer er blevet med held analyseret, først og fremmest i zebrafisk5, derefter mus6, og mennesker6,7. Selvom NGS er nu blevet et stærkt værktøj i studiet af den adaptive immunrespons, mangler grundlæggende analyser af fællestræk og forskelligheder i antistof repertoirer blandt enkelte dyr.
I mus, blev det rapporteret, at IgM repertoirer er næsten identiske mellem enkeltpersoner, mens IgG1 og IgG2c er væsentligt forskellige mellem enkeltpersoner8. Ud over V-gen usage profile er observerede frekvens i VDJ-profil i naive perifere B celler meget lignende mellem enkeltpersoner8. Analyse af aminosyresekvenser af regionen VDJ viste også forekomsten af de samme junctional sekvenser i forskellige mus meget hyppigere end tidligere troede8. Disse resultater viser, at mekanismer til repertoire antistofdannelse kan være deterministiske snarere end stokastiske5,8,9. Processen med antistof repertoire udvikling i mus har også været med succes analyseret ved hjælp af NGS yderligere fremhæve NGS potentiale til at afdække antistof immunsystemet i detaljer10.
I denne rapport beskriver vi en enkel og effektiv metode til at visualisere og analysere et antistof repertoire på verdensplan.
Metoden beskrevet her udnytter NGS for antistof RNA forstærkes ved hjælp af metoden 5′-RACE. I modsætning til metoder, der bruger degenererede 5′-VHansen gen primere, forstærkes mRNAs af hver antistof klasse jævnt ved hjælp af universelle fremad primere. Anvendelse af antisense primere specifikke for konstant-region 1 (CH1) af antistof-genet kan desuden repertoire profilering af specifikke immunoglobulin klasser. Dette er meget gavnligt for dissekere den klasse-specifikke antistofrespons samt for sammenligning af naiv og immuniserede repertoirer8,9.
En allersnarest faldgrube i metoden er en mangel på forstærkede immunoglobulin meddelelser. Dybden af antistof repertoire fremstillet ved denne protokol betydeligt afhænger af PCR-amplifikation beskrevet i trin 3.1 og 3.2. Hvis repertoire dybde ikke opnås ordentligt, anbefales skiftende forhold til skabelon cDNA og primere i trin 3.2.1 eller 3.2.2 kraftigt.
Generelt, ca 20% af antistof læser produceret af NGS er tvetydig sekvenser21. Selv med etableret “korrektion metoder”, 5-10% forblive tvetydig3. Vi, derfor analyseret sekvensen og filtreret rå læsninger indeholdende signatur sekvenser svarende til immunoglobulin konstant regioner (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, osv.). Dermed behov analyse af somatiske hyper-mutationer de omhyggelige undersøgelser.
En af begrænsningerne ved denne metode er at tunge immunoglobulin og lys kæde par ikke kan udledes. Visningen repertoire ved denne metode er derfor ikke holistisk. Det er dog muligt at tilnærme de top-ranking par af statistisk analyse af data10. Også, en roman metode til sekvens immunoglobulin par blev rapporteret seneste3,4.
Immunglobulin sekvenser i .fna outputdata blev udvundet, baseret på tilstedeværelsen af immunoglobulin signatur gensekvenser. V, D og J genet segmenter blev derefter kommenteret og produktiviteten i V (D) Jørgensen rearrangementer blev vurderet. Regionen komplementaritet-bestemmelse 3 (CDR3) sekvenser var også kommenteret. Disse systematiske undersøgelser af immunoglobulin sekvenser i .fna data blev med fordel fastsat af IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Opbygning af et automatiseret behandling pipeline har imidlertid merit til at analysere store eksperimentelle data. Rørledningen tilpasset til hvert formål er muligt at konfigurere ved hjælp af standalone IgBLAST protokol19. Denne tilgang har brug for grundlæggende programmering færdigheder men er meget nyttigt for detaljerede analyser af immunglobulin-systemet. Rørledningerne beskrevet er eksempler på tilpassede protokollen (figur 2).
Antallet af antistof læser, er proportional med mængden af antistof RNA’er i prøven, som afspejler antistof bestanddele af antistof system på givet tid point5,8,25. Metoden beskrevet her giver et fugleperspektiv af V (D) Jørgensen forfatningen af en antistof repertoire ved hjælp af R programmer8,18,26.
Den globale opfattelse af IgM-antistof repertoirer af individuelle naive mus viste en særdeles velbevarede VDJ-profil i forhold til de af IgG1 eller IgG2c8. Det blev rapporteret, at VDJ kombinationer af umodne zebrafisk er meget stereotype9. Derimod er menneskelige VDJ kombinationer rapporteret til at være meget skæv6. De yderst velbevarede deterministiske VDJ-profiler i naive B-celler er sandsynligvis genereret enten af skæv VDJ-rearrangementer eller negative udvalg med auto-antigener præsenteret i kroppen. For eksempel, IGHV11-2 udtrykkes fortrinsvis i føtal IgM repertoire27 og denne overvægt er tilskrevet autoreactivity af IGHV11-2 mod senescent erytrocytter27. Interessant, var IGHV11-2 også den mest almindelige store repertoire i vores tidligere udgivne analyse af naive IgM8.
Metoden beskrevet her er nyttig for decifrere antigen-responderende antistof repertoirer af portintervallet analysere antistof-repertoire plads genereret i individuelle organer, undgå utilsigtet udeladelsen af vigtige antistof repertoirer8, 10. Denne metode giver også mulighed for undersøgelse af detaljerede antistof netværk dynamik, der ville lette accelereret opdagelsen af beskyttende antistoffer mod nye patogener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra AMED under tilskud antal JP18fk0108011 (KO og SI) og JP18fm0208002 (TS, KO og YO), og en licensbetaling fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (15K 15159) til KO. Vi takker Sayuri Yamaguchi og Satoko Sasaki for de værdifulde tekniske bistand. Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) til Dansk sprog redigering.
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |