Her beskriver vi protokoller for analyse og visualisering av strukturen og Grunnloven av hele antistoff repertoar. Dette innebærer anskaffelse av store sekvenser av antistoff med neste generasjons sekvensering.
Enorm tilpasningsevne antigen anerkjennelse av antistoffer er grunnlaget for det ervervet immun systemet. Til tross for vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende produksjon av det store repertoaret av antistoffer av ervervet uimottakelig systems, er det ennå ikke mulig å komme frem til en global oversikt over et komplett antistoff repertoar. Spesielt har B celle repertoar vært betraktet som en svart boks på grunn av deres astronomiske antallet antistoff kloner. Neste generasjons sekvensering teknologi er imidlertid slik at gjennombrudd for å øke vår forståelse av B celle repertoaret. I denne rapporten beskriver vi en enkel og effektiv metode for å visualisere og analysere hele personlige musen og menneskelige antistoff repertoar. Fra immun organer var representatively fra milt i mus og perifert blod mononukleære celler hos mennesker, totalt RNA forberedt, reverse transkribert og forsterket med metoden 5′-løp. Bruke en universell frem primer og antisense primere for antistoff klasse-spesifikke konstant domenene, var antistoff mRNAs jevnt forsterket i proporsjoner reflekterer frekvenser antistoff bestander. Amplicons ble sekvensert av neste generasjons sekvensering (NGS), gir mer enn 105 antistoff sekvenser per immunologiske prøve. Vi beskriver protokollene for antistoff sekvens analyser inkludert V (D) J-gen-segmentet merknad, et fugleperspektiv av antistoff repertoar, og vår beregningsorientert metoder.
Antistoff systemet er en av grunnleggende av ervervet immunsystemet. Det er svært potent mot invaderende patogener sin enorme mangfold, fine antigen anerkjennelse spesifisitet og klonal utvidelse av antigen-spesifikke B-celler. Repertoaret av antistoff-produserende B-celler er anslått til mer enn 1015 i en enkelt personlige1. Dette enorme mangfoldet genereres ved hjelp av VDJ genet rekombinasjon i immunglobulin genetisk loci2. Beskrivelse av hele B-cellen repertoar og deres dynamiske endringer i respons til antigen-immunisering er derfor utfordrende, men avgjørende for en fullstendig forståelse av antistoff respons mot invaderende patogener.
På grunn av deres astronomiske mangfold, har B celle repertoar vært betraktet som en svart boks; men har ankomsten av NGS teknologi aktivert gjennombrudd til en bedre forståelse av sine kompleksitet3,4. Hele antistoff repertoar er vellykket analysert, først i sebrafisk5, deretter mus6, og mennesker6,7. Selv om NGS har nå blitt et kraftig verktøy i studiet av adaptive immunforsvaret, mangler grunnleggende analyser av fellestrekk og forskjeller i antistoff repertoar blant enkelte dyr.
I mus, ble det rapportert at IgM repertoar er nesten identisk mellom individer, mens IgG1 og IgG2c er vesentlig forskjellig mellom individer8. V-genet bruksprofil er observerte frekvensen av VDJ profil i naiv perifere B-celler svært lignende mellom individer8. Analyse av amino acid sekvenser av VDJ-regionen viste også forekomsten av den samme junctional sekvenser i forskjellige mus mye oftere enn tidligere trodde8. Disse resultatene indikerer at mekanismene for antistoff repertoar dannelsen kan være deterministisk i stedet for Stokastisk5,8,9. Prosessen med antistoff repertoar utvikling i mus har også vært vellykket analysert ved hjelp av NGS ytterligere utheve potensialet i NGS å avdekke antistoff immunsystemet i detalj10.
I denne rapporten beskriver vi en enkel og effektiv metode for å visualisere og analysere et antistoff repertoar på et globalt nivå.
Metoden beskrevet her benytter NGS for antistoff RNA forsterket med metoden 5′-løp. I motsetning til metoder som bruker degenerert 5′-VH genet primere, er mRNAs av hver antistoff klasse forsterket jevnt med universell frem primere. I tillegg kan bruken av antisense primere bestemt for konstant-regionen 1 (CH1) av antistoff genet repertoar profilering av bestemte immunglobulin klasser. Dette er svært gunstig for dissekere klasse-spesifikke antistoffet svaret og sammenligne naiv og vaksineres repertoar8,9.
En passende fallgruve metoden er en paucity forsterket immunglobulin meldinger. Dybden av antistoff repertoar innhentet av denne protokollen vesentlig avhenger PCR forsterkning beskrevet i trinnene 3.1 og 3.2. Hvis repertoar dybden ikke skal oppnås, anbefales det sterkt at du endrer prosenter av malen cDNA og primere i trinn 3.2.1 eller 3.2.2.
Vanligvis er omtrent 20% i antistoff lyder produsert av NGS tvetydig sekvenser21. Selv med etablerte “korreksjonsmetoder”, 5-10% være tvetydig3. Vi har derfor analysert sekvensen og filtrert lese rådata som inneholder signatur sekvenser tilsvarer immunglobulin konstant regioner (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etc.). Dermed må analyse av somatiske hyper-mutasjoner forsiktig eksamen.
En av begrensningene i denne metoden er at immunglobulin tunge og lys kjeden par kan ikke utledes. Derav er visningen repertoar ved denne metoden ikke Holistisk. Det er imidlertid mulig å omtrentlige topp-ranking parene av statistisk analyse av data10. Også rapporterte en ny metode sekvensen immunglobulin parene var nylig3,4.
Immunglobulin sekvenser i .fna utdataene ble hentet basert på tilstedeværelsen av immunglobulin gensekvenser signatur. V, D og J genet segmenter ble deretter kommentert og produktiviteten til V (D) J rearrangements ble vurdert. Regionen komplementaritet-bestemme 3 (CDR3) sekvenser ble også kommentert. Disse systematisk undersøkelser av immunglobulin sekvenser i .fna data ble nyttig levert av IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Bygge en automatisert forløpet har imidlertid de fortjener å analysere store eksperimentelle data. Rørledningen tilpasset formålet er mulig å sette opp ved hjelp av frittstående IgBLAST protokollen19. Denne tilnærmingen må grunnleggende programmering leseferdighet, men er svært nyttig for detaljerte analyser av immunglobulin systemet. Rørledningene beskrevet er eksempler på tilpassede protokollen (figur 2).
Antall antistoff leser er proporsjonal med mengden av antistoff RNAs i utvalget, reflekterer antistoff spesialpreparatets antistoff systemet gitt tid poeng5,8,25. Metoden beskrevet her gir et fugleperspektiv av et antistoff repertoar bruker R programmer8,18,26V (D) J grunnlov.
Globale visningen av IgM antistoffer repertoar av personlige naiv mus avslørte en høyt konservert VDJ-profil i forhold til de IgG1 eller IgG2c8. Det ble rapportert at VDJ kombinasjoner av umodne sebrafisk er svært stereotype9. Derimot er menneskelige VDJ kombinasjoner rapportert å være svært skjev6. Høyt konservert deterministisk VDJ-profilene i naiv B celler er sannsynligvis generert enten av skjev VDJ-rearrangements eller negativ utvalg med auto-antigener presentert i kroppen. For eksempel IGHV11-2 uttrykkes fortrinnsvis de fosterets IgM repertoar27 og dette overvekt er knyttet til autoreactivity av IGHV11-2 mot senescent erytrocytter27. Interessant, var IGHV11-2 også det vanligste store repertoaret i vår tidligere publiserte analyse av naiv IgM8.
Metoden beskrevet her er nyttig for å tyde antigen-responsive antistoff repertoar av inclusively analyse av antistoff-repertoaret plassen generert i individuelle organer, unngå utilsiktet unnlatelse av viktige antistoff repertoar8, 10. Denne metoden tillater også undersøkelse av detaljert antistoff nettverk dynamikk, som vil lette akselerert oppdagelsen av beskyttende antistoffer mot nye patogener.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra AMED under Grant nummer JP18fk0108011 (KO og SI) og JP18fm0208002 (TS, KO og kast), og en Grant-in-Aid fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (15K 15159) til KO. Vi takker Sayuri Yamaguchi og Satoko Sasaki for verdifull teknisk assistanse. Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk redigering.
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |