Här beskriver vi protokoll för analys och visualisering av strukturen och konstitutionen av hela antikropp repertoarer. Detta innebär förvärvet av stora sekvenser av antikropp RNA med hjälp av nästa generations sekvensering.
Antigen erkännande av antikroppar enorma anpassningsförmåga är grunden för förvärvade immunsystemet. Trots vår förståelse av de molekylära mekanismerna bakom produktionen av den stora repertoaren av antikroppar av de förvärvade immunsystemet, har det ännu inte möjligt att komma fram till en övergripande bild av en fullständig antikropp repertoar. Särskilt har B-cell repertoarer betraktats som en svart låda på grund av deras astronomiska antal antikroppar kloner. Men möjliggör nästa generations sekvensering teknik genombrott att öka vår förståelse av B-cell repertoar. I den här rapporten beskriver vi en enkel och effektiv metod för att visualisera och analysera hela enskilda mus och human antikropp repertoarer. Från de immun organ var olikt från mjälten hos möss och perifera mononukleära blodceller hos människor, total-RNA beredda, omvänd transkriberas och förstärks med metoden 5′-RACE. Med en universell framåt primer och antisense primers för antikropp klass-specifika konstant domäner, var antikropp mRNA enhetligt förstärks i proportioner som återspeglar deras frekvenser i antikropp populationer. Amplikoner var sekvenserade av nästa generations sekvensering (NGS), vilket ger mer än 105 antikropp sekvenser per immunologiskt prov. Vi beskriver protokoll för antikropp sekvensanalys inklusive V D J-gen-segmentet kommentar, ett fågelperspektiv av antikropp repertoaren och våra beräkningsmetoder.
Systemets antikropp är en av grunderna i förvärvade immunsystemet. Det är mycket potent mot invaderande patogener på grund av dess stora mångfald, fina antigen erkännande specificitet och den klonal expansionen av antigen-specifika B-celler. Repertoar av antikropp-B celler uppskattas till mer än 1015 i ett enda enskilda1. Denna enorma mångfald genereras med hjälp av VDJ gen rekombination i immunglobulin genregioner2. Beskrivning av hela B-cell repertoarer och deras dynamiska förändringar som svar på antigen-immunisering är därför utmanande, men avgörande för en fullständig förståelse av antikroppssvaret mot invaderande patogener.
På grund av deras astronomiska mångfald, har B-cell repertoarer betraktats som en svart låda; men har tillkomsten av NGS teknik gjort genombrott till en förbättrad förståelse av deras komplexitet3,4. Hela antikropp repertoarer har analyserats framgångsrikt, det första i Zebrafiskar5, sedan möss6, och människor6,7. Även om NGS har nu blivit ett kraftfullt verktyg i studiet av det adaptiva immunsvaret, saknas grundläggande analyser av likheter och skillnader i antikropp repertoarer bland enskilda djur.
Hos möss rapporterades det att IgM repertoarer är nästan identiska mellan individer, de av IgG1 och IgG2c skiljer sig avsevärt mellan individer8. Förutom V-gen användningsprofil är observerade frekvensen av VDJ-profil i naiva perifera B-celler mycket liknande mellan individer8. Analysen av de amino syra ordnar av VDJ-regionen visade också förekomsten av samma Junktional sekvenser i olika möss mycket oftare än tidigare trodde8. Dessa resultat tyder på att mekanismerna för den repertoar antikroppsbildning kan vara deterministiska i stället för stokastiska5,8,9. Processen för utveckling av antikroppar repertoar i möss har också varit framgångsrikt analyseras med NGS att ytterligare belysa NGS potential att avslöja immunförsvaret antikroppar i detalj10.
I den här rapporten beskriver vi en enkel och effektiv metod för att visualisera och analysera en antikropp repertoar på global nivå.
Den metod som beskrivs här använder NGS för antikropp RNA förstärks med metoden 5′-RACE. I motsats till metoder som använder degenererade 5′-VH gen primers, förstärks mRNA av varje antikropp klass jämnt med universella framåt primers. Dessutom möjliggör användningen av antisense grundfärger specifika för konstant-region 1 (CH1) av antikropp genen repertoar profilering av specifikt immunglobulin klasser. Detta är mycket fördelaktigt för dissekera klass-specifika antikroppssvaret samt jämföra naiva och immuniserade repertoarer8,9.
En troligen fallgrop för metoden är en brist på förstärkta immunglobulin meddelanden. Djupet av antikropp repertoar erhålls genom detta protokoll väsentligen beror på den PCR-amplifiering beskrivs i steg 3.1 och 3.2. Om repertoar djupet inte erhålls ordentligt, rekommenderas ändra företagets nyckeltal mall cDNA och primers i steg 3.2.1 eller 3.2.2 starkt.
Generellt är cirka 20% av antikropp läser produceras av NGS tvetydiga sekvenser21. Även med etablerade ”korrigering metoder”, 5-10% kvar tvetydiga3. Vi har därför analyseras sekvensen och filtreras raw-läsningar som innehåller signatur sekvenser motsvarar immunglobulin konstanta regioner (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etc.). Därmed behov en analys av somatiska hyper-mutationer av noggranna undersökningar.
En av begränsningarna med denna metod är att immunglobulin tunga och lätta kedjan par kan inte utläsas. Därav är vyn repertoar som erhålls med denna metod inte holistisk. Det är dock möjligt att tillnärma de topprankade paren av statistisk analys av data10. Också, en ny metod för att sekvensen immunglobulin paren var rapporterade nyligen3,4.
Immunglobulin sekvenser i .fna utdata utvanns baserat på förekomsten av immunglobulin signatur gensekvenser. Genen V, D och J segment var sedan kommenterade och produktiviteten i V (D) J rearrangements bedömdes. Regionen komplementaritet-bestämning 3 (CDR3) sekvenser var också kommenterade. Dessa systematiska undersökningar av immunglobulin sekvenser i .fna data tillhandahölls med fördel av de IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Bygga en automatiserad bearbetning pipeline har dock fördelen att analysera stora experimentella data. Rörledningen anpassade för varje ändamål är möjligt att ställa in med hjälp av fristående IgBLAST protokoll19. Detta tillvägagångssätt måste grundläggande programmering läskunnighet men är mycket användbart för detaljerade analyser av immunglobulin systemet. De rörledningar som beskrivs är exempel på anpassade protokollet (figur 2).
Antalet antikropp läser ges i proportion till mängden antikroppar RNAs i provet, reflekterande antikropp beståndsdelarna av antikropp systemet på tid punkter5,8,25. Den metod som beskrivs här ger en fågelperspektiv av V (D) J konstitutionen av en antikropp repertoar använder R program8,18,26.
Global synvinkel IgM antikropp repertoarer av enskilda naiva möss visade en mycket VDJ-profil jämfört med de av IgG1 eller IgG2c8. Det rapporterades att VDJ kombinationer av omogna Zebrafiskar är mycket stereotypa9. Däremot redovisas mänskliga VDJ kombinationer vara mycket skev6. Mycket deterministiska VDJ-profilerna i naiva B-celler är förmodligen genereras antingen av skeva VDJ-omflyttningar eller negativa urval med auto-antigener presenteras i kroppen. Till exempel IGHV11-2 uttrycks prioriterat i fostrets IgM repertoar27 och denna dominans tillskrivs autoreactivity IGHV11-2 mot senescent erytrocyter27. Intressant, var IGHV11-2 också den vanligaste stora repertoaren i vår tidigare publicerade analys av naiva IgM8.
Den metod som beskrivs här är användbar för att dechiffrera antigen-lyhörd antikropp repertoarer av inklusive analysera antikropp-repertoar utrymmet genereras i enskilda organ, undvika oavsiktlig utelämnande av viktiga antikroppar repertoarer8, 10. Denna metod kan också granskningen av detaljerade antikropp nätverk dynamik, vilket skulle underlätta accelererade upptäckten av skyddande antikroppar mot nya framväxande patogener.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ett bidrag från AMED under Grant nummer JP18fk0108011 (KO och SI) och JP18fm0208002 (TS, KO, och YO), och ett bidrag från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (15K 15159) till KO. Vi tackar Sayuri Yamaguchi och Satoko Sasaki med värdefulla tekniska bistånd. Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelska språket redigering.
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |