I denne protokol beskriver vi den fulde proces af eksperimentelle nærsynethed tilskyndelse i mus med nydesignede briller og den teknik, der er nødvendige for at opnå stabil og reproducerbare resultater i okulær parameter målinger.
Murine model af nærsynethed kan være et effektivt redskab for nærsynethed forskning på grund af den forholdsvis let genmanipulation. Én måde at fremkalde nærsynethed i dyr er at sætte klare minus linser foran øjnene for uger (linse-induceret nærsynethed, LIM). Men bevarede protokoller for tilskyndelse og evaluering varierer fra laboratorium til laboratorium. Her, beskrevet vi en meget praktisk og reproducerbar metode til at fremkalde LIM i mus med nydesignede briller. Metode rettelser linse stabilt foran musen øjet samtidig giver mulighed for linsen at være taget ud til rengøring eller aktuelle medicin administration. Fænotype er robuste og effektive, og afvigelsen er lille. Metoden beskrives her kan anvendes på mus lige efter fravænning, som udvider den mulige varighed for eksperimenter. Vi gav også teknisk rådgiver for reproducerbare resultater i brydning og aksial længde målinger. Vi håber den trinvise protokollen beskrevet her og detaljeret artiklen kan hjælpe forskerne med at udføre nærsynethed eksperimenter med nærsynethed mere smidigt og gøre dataene sammenlignelige på tværs af laboratorier.
Forekomsten af nærsynethed er steget dramatisk for nylig, mens mekanismen af dens debut og progression er stadig i vid udstrækning unknow1. Den mest karakteristiske Fænotypen af nærsynethed er strækning af aksial længde (AL), hvilket øger risikoen for retinal komplikationer eller endda blindhed2. For bedre at forstå patogenesen af nærsynethed og udvikle effektive behandlinger, er robust nærsynet dyremodeller og stabil fænotype evaluering nødvendig.
Kort, to metoder eksisterer for at fremkalde nærsynet stater i dyr: form-afsavn Nærsynethed (FDM) og linse-induceret Nærsynethed (LIM)3. Førstnævnte steder diffusorer foran øjet eller sutures øjenlåg for at sløre billedet, som påvirker den normale udvikling af øjeæblet, hvilket resulterer i en nærsynethed fænotype. De sidstnævnte steder minus linser foran øjet flytte omdrejningspunkt bag nethinden. Nethinden registrerer en forskydning af fokus og elongates øjeæblet for at justere nethinden og omdrejningspunkt. For FDM, efter øjenlåget er lukket eller diffuser har været fast foran øjet, er næsten ingen yderligere vedligeholdelse nødvendig. Linsen skal tages af for rensning for at holde det gennemsigtige for LIM. FDM er således relativt let at være induceret teknisk. Men mekanismerne af FDM og LIM er forskellige, og hvilken metode efterligner nærsynethed i menneskelige bedre er stadig under debat3. En af styrkerne ved LIM er stærkere fænotype sammenlignet med FDM, i det mindste i forbindelse med mus4.
Dyr, der har været anvendt for at fremkalde nærsynethed omfatter kyllinger5, aber6, tree spidsmus7, marsvin8og mus4. I betragtning af muligheden for genmanipulation, rigelige tilgængelige antistoffer og lave omkostninger til avl, kunne mus have været førstevalg som dyremodel for nærsynethed. Sammenlignet med andre større dyr, er fastsættelse linser eller diffusorer foran musen øjet dog relativt vanskeligt især for unge mus som lige efter fravænning. For de eksperimenter, der har brug for aktuel drug administration eller flere mellemliggende øje målinger, er det også nødvendigt, at rammen skal være flytbare. En anden udfordring er den lille morfologisk ændring af mus øjeæblet, som har bør for avancerede teknik og enheder til at evaluere. Til dato har forskellige inducerende og måling af protokoller, der bruges i forskellige forskningsgrupper gør det svært at sammenligne og gentage resultaterne på tværs af laboratorier. En standardprotokol med detaljer er nødvendig.
Tidligere værker beskrives flere metoder til at løse linser eller diffusorer foran musen øjet, såsom limning9, syning10 og hoved-monteret goggle frame11,12. Vi kombineret exist hovedmonteret goggle technics11,12,13 med vores nydesignede ramme til at udvikle en afhjælpes protokol for at fremkalde robust og effektiv eksperimentelle nærsynethed i mus. Protokollen kan anvendes til unge mus snarest efter fravænning på postnatal dag 21 (p21). Vi har også optimeret processerne for stabil og præcis vurdering af fænotyper herunder brydning og AL. Vi håber, denne standardiseret protokol kan bidrage til at gøre nærsynet mus en mere lettilgængelig model for nærsynethed forskning.
For at sikre, at briller skal fastsættes stabilt på musen hovedet, skal flere trin i denne protokol være stor opmærksomhed. Periosteum skal fjernes helt før ved hjælp af dental selvklæbende system. Blod på kraniet skal også renses op med omhu. Mens en lille finjustering er acceptabelt lige efter påføring af limen, Flyt ikke stick ofte før den selvklæbende system tørre op. Følg instruktion af den selvklæbende system omhyggeligt, især forholdet mellem hver enkelt komponent af den endelige blanding. Hvornå…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker M.T. Pardue for rådgivning om SDOCT, F. Schaeffel for rådgivning på målinger af brydning og hornhinde krumning, Mr. Sanshouo for at genskabe den tre-dimensionelle rammedata, M. Miyauchi; K. Tsubota; Y. Tanaka; S. Kondo; C. Shoda; M. Ibuki; Y. Miwa; Y. af洼田空穂麦草句碑Hagiwara; A. Ishida; Y. Tomita; Y. Katada; E. Yotsukura; K. Takahashi; og Y. Wang for kritiske diskussioner. Dette arbejde blev støttet af tilskud inAid for videnskabelig forskning (KAKENHI, nummer 15K 10881) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) til TK. Dette arbejde er også støttet af tilskud for nærsynethed forskning fra Tsubota laboratorium, Inc. (Tokyo Japan).
screw | NBK | SNZS-M1.4-10 | |
washer | MonotaRO | 42166397 | |
nut | MonotaRO | 42214243 | |
stick | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
frame | DMM Make | none | designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make. |
lenses | RAINBOW CONTACT LENS | none | customized for mice use by the company |
cyanoacrylate glue | OK MODEL | MP 20g | |
dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | super bond | contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull |
infrared photorefractor | Steinbeis Transfer Center | none | designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen |
Spectral domain OCT | Leica | R4310 | |
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution | Santen | Mydrin-P | |
midazolam | Sandoz K.K. | SANDOZ | components for the anesthetic |
medetomidine | Orion Corporation | Domitor | components for the anesthetic |
butorphanol tartrate | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | components for the anesthetic |
0.1 % purified sodium hyaluronate | Santen | Hyalein | |
atipamezole hydrochloride | Zenoaq | antisedan |