Incentivo e avaliação de um modelo murino de miopia Experimental

Summary

Neste protocolo, descrevemos o processo completo de miopia experimental incentivo nos ratos usando recém-projetado óculos e a técnica necessários para alcançar resultados estáveis e reprodutíveis em medições de parâmetro ocular.

Abstract

Modelo murino de miopia pode ser uma ferramenta poderosa para a investigação de miopia por causa da manipulação genética comparativamente fácil. Uma maneira de induzir a miopia em animais é colocar claro menos lentes na frente dos olhos por semanas (miopia induzida pela lente, LIM). No entanto, os protocolos existentes de incentivo e de avaliação variam de laboratório para laboratório. Aqui, descrevemos um método altamente prático e reprodutível para induzir óculos LIM em ratos usando recentemente projetado. As correções de método a lente estàvel na frente do olho de rato, enquanto permite que a lente a ser retirado para limpeza ou tópica de administração de drogas. O fenótipo é robusta e eficiente, e a variação é pequena. O método descrito aqui pode ser aplicado aos ratos logo após o desmame que se estende a duração possível para experimentos. Nós também demos técnico aconselha para alcançar resultados reprodutíveis em refração e medições de comprimento axial. Esperamos que o protocolo passo a passo descrito aqui e o artigo detalhado pode ajudar os pesquisadores a realizar experimentos de miopia com miopia mais suave e tornar os dados comparáveis entre laboratórios.

Introduction

A prevalência de miopia aumentou dramaticamente recentemente, enquanto o mecanismo de seu aparecimento e progressão são ainda em grande parte desconhecido¹. O fenótipo mais característico da miopia é o alongamento do comprimento axial (AL), que aumenta o risco de complicações na retina ou mesmo cegueira². Para melhor compreender a patogênese da miopia e desenvolver tratamentos eficazes, modelos animais míopes robustos e estável fenótipo avaliação são necessárias.

Brevemente, existem dois métodos para induzir Estados míopes em animais: formulário-privação miopia (FDM) e miopia induzida pela lente (LIM)³. O primeiro coloca os difusores na frente do olho ou sutura da pálpebra para obscurecer a imagem, o que influencia o desenvolvimento normal do globo ocular, resultando em um fenótipo de miopia. Os últimos lugares menos lentes na frente do olho para mover o ponto de foco atrás da retina. A retina detecta a mudança do foco e alonga o globo ocular para realinhar a retina e o ponto focal. Para FDM, depois que a pálpebra está fechada ou o difusor foi corrigido na frente do olho, quase nenhuma manutenção adicional é necessária. Para LIM, a lente precisa ser retirado para limpeza a fim de mantê-lo transparente. Assim, o FDM é relativamente fácil de ser induzido tecnicamente. No entanto, os mecanismos de FDM e LIM são diferentes, e qual método imita a miopia em humanos é melhor ainda em debate³. Um dos pontos fortes de LIM é o fenótipo mais forte comparado com FDM, pelo menos no caso de ratos⁴.

Animais que foram usados para indução de miopia incluem filhotes⁵macacos⁶, árvore shrews⁷, cobaias⁸e ratos⁴. Considerando a possibilidade de manipulação genética, anticorpos disponíveis abundantes e baixo custo para reprodução, ratos poderiam ter sido a primeira escolha como o modelo animal de miopia. No entanto, em comparação com outros animais maiores, fixação lentes ou difusores na frente do olho do rato é relativamente difícil, especialmente para jovens ratos como direito após o desmame. Para os experimentos que precisam de administração tópica da droga ou várias medições provisórias de olho, também é necessário o quadro a ser removível. Outro desafio é a pequena alteração morfológica do globo ocular do mouse, que precisa de técnicas sofisticadas e dispositivos para avaliar. Até à data, induzindo diferentes e protocolos usados em equipas de investigação diferentes de medição tornam difícil comparar e repetir os resultados através de laboratórios. É necessário um protocolo padrão com detalhes.

Trabalhos anteriores descreveram vários métodos para corrigir as lentes ou difusores na frente do olho de rato, tais como a colagem de⁹,¹⁰ e capacetes goggle quadro^11,12de costura. Nós combinamos a exist capacetes goggle técnicas^11,12,13 com nosso quadro recentemente projetado para desenvolver um protocolo melhorou para induzir robusta e eficiente de miopia experimental em ratos. O protocolo pode ser aplicado aos ratos jovens logo após o desmame no pós-Natal dia 21 (p21). Nós também Aperfeiçoamos os processos de avaliação estável e precisa de fenótipos incluindo a refração e AL. Esperamos que este protocolo padronizado pode ajudar a tornar ratos míopes um modelo mais facilmente acessível para a pesquisa de miopia.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética em pesquisa Animal de Keio University School of Medicine aderiu à instrução ARVO para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research, as orientações institucionais sobre experimentação Animal na Keio Universidade e a pesquisa Animal: relatórios no Vivo experimentos (chegada) orientações para o uso de animais na investigação. 1. montar os óculos para ratos Prepare peças para montagem de óculos (<strong cl…

Representative Results

Pelo primeiro, verifique se todas as peças necessárias são preparadas (Figura 1a). Um exemplo de uma peça de óculos montados é mostrado na Figura 1b. Exceto para o corpo principal dos quadros e a porca, todas as outras partes são descartáveis para cada rato. Um conjunto de óculos completados é mostrado na Figura 1 c. Altere o ângulo entre os dois quadros para caber o mouse com diferentes i…

Discussion

Para garantir que o óculos a fixar estàvel na cabeça do rato, várias etapas neste protocolo precisam ser prestado grande atenção. O periósteo deve ser removido completamente antes de usar o sistema adesivo dental. O sangue no crânio também precisa ser limpo com cuidado. Enquanto um pequeno ajuste fino é aceitável, logo após a aplicação do adesivo, não mova o stick frequentemente antes que o sistema adesivo secar. Siga as instruções do sistema adesivo com cuidado, especialmente a proporção de cada compo…

Materials

screw	NBK	SNZS-M1.4-10
washer	MonotaRO	42166397
nut	MonotaRO	42214243
stick	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
frame	DMM Make	none	designed by authers and output by the 3D printer rented from DMM Make.
lenses	RAINBOW CONTACT LENS	none	customized for mice use by the company
cyanoacrylate glue	OK MODEL	MP 20g
dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	super bond	contains the etching liquid used for removing the periosteum of the mouse skull
infrared photorefractor	Steinbeis Transfer Center	none	designed and offered by Dr. Frank Schaeffel from university of Tübingen
Spectral domain OCT	Leica	R4310
Tropicamide, Penylephrine Hydrochloride solution	Santen	Mydrin-P
midazolam	Sandoz K.K.	SANDOZ	components for the anesthetic
medetomidine	Orion Corporation	Domitor	components for the anesthetic
butorphanol tartrate	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	components for the anesthetic
0.1 % purified sodium hyaluronate	Santen	Hyalein
atipamezole hydrochloride	Zenoaq	antisedan