Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen
Summary
Wir bieten Protokolle zur Evaluation von mesenchymalen Stammzellen isoliert von Zahnpulpa und Prostata-Krebs-Zell-Interaktionen basierend auf direkten und indirekten Co Kulturmethoden. Zustand Medium und Trans-gut Membranen eignen sich zur indirekten parakrine Aktivität zu analysieren. Seeding differentiell ist gefärbten Zellen zusammen ein geeignetes Modell für direkten Zell-Zell-Interaktion.
Abstract
Krebs als mehrstufiger Prozess und komplizierte Krankheit ist nicht nur von einzelnen Zellproliferation und Wachstum reguliert aber auch Tumor-Umgebung und Zell-Zell-Interaktionen gesteuert. Identifizierung von Krebs und Stammzell-Interaktionen, einschließlich Änderungen der extrazellulären Umgebung, physikalischen Wechselwirkungen und sezernierten Faktoren, könnte die Entdeckung von neuen Therapieoptionen ermöglichen. Wir kombinieren bekannte Kokultur Techniken um ein Modellsystem zur mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Krebs Zell-Interaktionen zu erstellen. In der aktuellen Studie wurden durch direkte und indirekte Co Kulturtechniken Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs) und PC-3-Prostata-Krebs-Zell-Interaktionen untersucht. Zustand-Medium (CM) aus DPSCs und 0,4 µm Größe Pore Trans-gut Membranen wurden verwendet, um parakrine Aktivität zu studieren. Kokultur verschiedener Zelltypen wurde gemeinsam durchgeführt, um direkten Zell-Zell-Interaktion zu studieren. Die Ergebnisse zeigten, dass CM Zellproliferation erhöht und Apoptose in Zellkulturen Prostatakrebs verringert. CM und Trans-gut System Kapazitätssteigerung Zelle Migration von PC-3 Zellen. Zellen mit verschiedenen Membran Farbstoffen gefärbt wurden in der gleichen Kulturgefäße entkernt und DPSCs nahmen an einer selbstorganisierten Struktur mit PC-3 Zellen unter diesen direkten Kokultur Zustand. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass Kokultur Techniken als Modellsystem für Krebs und MSC Interaktionen nützlich sein könnten.
Introduction
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs), mit der Möglichkeit der Differenzierung und Beitrag zur Regeneration von mesenchymalen Geweben wie Knochen, Knorpel, Muskeln, Bänder, Sehnen und Fettgewebe, wurden von fast allen Geweben im Körper eines Erwachsenen1 isoliert , 2. außer Bereitstellung von Gewebe Homöostase von produzierenden residente Zellen im Falle einer chronischen Entzündung oder einer Verletzung, sie produzieren lebenswichtige Zytokine und Wachstumsfaktoren, Angiogenese, Immunsystem und Gewebe Umbau3zu orchestrieren. Das Zusammenspiel von MSCs mit Krebsgewebe ist nicht gut verstanden, aber sammeln Hinweise darauf, dass MSCs Tumor Einleitung, Progression und Metastasierung4fördern könnte.
Die zielsuchende Fähigkeit der MSCs auf den verletzten oder chronisch entzündeten Bereich macht sie eine wertvolle Kandidat für stammzellbasierte Therapien. Jedoch frei Krebsgewebe, “niemals Wunden zu heilen”, auch inflammatorischen Zytokinen, Pro-angiogenen Moleküle und wichtige Wachstumsfaktoren, die MSCs auf Cancerogenous Gebiet5zu gewinnen. Zwar gibt es begrenzte berichtet Berichte zeigen hemmende Wirkung von MSCs auf Krebs Wachstum6,7, Tumorprogression und deren Metastasen Förderung Effekte ausgiebig gewesen8. MSCs beeinflussen direkt oder indirekt Karzinogenese auf unterschiedliche Weise einschließlich Unterdrückung von Immunzellen, die Sekretion von Wachstumsfaktoren/Zytokine, die Krebs-Zell-Proliferation und Migration, Verbesserung angiogene Aktivität und Regulierung unterstützen epitheliale-mesenchymale Transition (EMT)9,10. Tumor-Umgebung besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) und/oder Myofibroblasts, Endothelzellen, Adipozyten und Immunzellen11. CAFs sind diejenigen die am häufigsten vorkommenden Zelltyp im Bereich Tumor, die verschiedenen Chemokine fördern Krebs Wachstum und Metastasierung8absondern. Es hat sich gezeigt, dass Knochenmark stammenden MSCs in CAFs in der Tumor-Stroma-12differenzieren können.
Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs), als die ersten dental Gewebe abgeleitet MSCs zeichnet sich durch Gronthos Et al. 13 im Jahr 2000 und dann weit von anderen untersuchten14,15, express Pluripotenz Markierungen wie Oct4, Sox2und Nanog16 und kann in verschiedenen Zelle Linages17unterscheiden. Gen und Protein Expressionsanalyse bewiesen, dass DPSCs vergleichbarem Wachstumsfaktoren/Zytokine mit anderen MSCs wie vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Angiogenin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2), Interleukin-4 (IL-4), produzieren IL-6, IL-10, und Stammzell-Faktor (SCF) sowie Fms-wie Tyrosin-Kinase-3 Liganden (Flt – 3L), die Förderung der Angiogenese, modulieren Immunzellen, und unterstützen Krebs-Zell-Proliferation und Migration18,19,20 . Während die Wechselwirkungen von MSCs mit Krebs-Umgebung in der Literatur gut dokumentiert wurden, wurde die Beziehung zwischen DPSCs und Krebszellen noch nicht ausgewertet. In der vorliegenden Studie haben wir Kokulturen und Zustand mittlerer Behandlungsstrategien für eine höchst metastasierendem Prostatakrebs-Zelllinie, PC-3 und DPSCs, mögliche Maßnahmen des Mechanismus der zahnärztlichen MSCs Tumorprogression und Metastasierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beitrag von MSCs zur Tumor-Umgebung ist durch mehrere Interaktionen einschließlich Hybrid Zelle Generation über Zelle Fusionen, Entosis oder Cytokine und Chemokin Aktivitäten zwischen Stammzellen und Krebs Zellen28geregelt. Aufbauorganisation, Zell-Zell-Interaktionen und sezernierten Faktoren bestimmen Krebs Zelle Verhalten in Bezug auf die Tumor-Promotion, Progression und Metastasierung in die umliegenden Gewebe. Richtige ex Vivo Modellsysteme untersuchen die Mechanismen hint…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch Yeditepe Universität. Alle Daten und Zahlen in diesem Artikel verwendeten waren zuvor veröffentlichten34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
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