Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações
Summary
Nós fornecemos os protocolos para avaliação de células-tronco mesenquimais isoladas de polpa dentária e interações de células de câncer de próstata baseadas em métodos diretos e indiretos co-cultura. Médio de condição e membranas de trans-bem são apropriadas analisar a atividade indireta parácrina. Semeando diferencialmente manchado células juntos é um modelo adequado para a interação célula-célula direto.
Abstract
Câncer como um processo de várias etapas e doença complicada é não só regulado pelo crescimento e proliferação das células individuais, mas também controlada por interações de ambiente e célula-célula de tumor. Identificação de câncer e interações de células-tronco, incluindo alterações no ambiente extracelular, interações físicas e fatores secretados, poderá permitir a descoberta de novas opções de terapia. Aliamos técnicas de co-cultura conhecidos para criar um sistema de modelo para as células-tronco mesenquimais (MSCs) e câncer interações célula. No estudo atual, as células-tronco polpa dental (DPSCs) e interações de células de câncer de próstata PC-3 foram examinadas por técnicas de co-cultura diretos e indiretos. Médio de condição (CM) obtidos de DPSCs e 0,4 µm de tamanho de poros bem trans membranas foram usadas para estudar a atividade parácrina. Co-cultura de diferentes tipos de células juntos foi realizada para estudar a interação célula-célula direto. Os resultados revelaram que CM aumentou a proliferação celular e diminuição da apoptose em cultura de células de câncer de próstata. Tanto CM e sistema de trans-bem aumentaram a capacidade de migração celular de células PC-3. Células coradas com membrana diferentes corantes foram semeadas em vasos cultura mesmo, e DPSCs participaram em uma estrutura auto-organizada com PC-3 células sob essa condição de co-cultura direto. Em geral, os resultados indicaram que as técnicas de cultura co poderiam ser útil para câncer e interações MSC como um sistema modelo.
Introduction
Células-tronco mesenquimais (MSCs), com a capacidade de diferenciação e contributo para a regeneração dos tecidos mesenquimais como osso, cartilagem, músculo, ligamento, tendão e adiposo, têm sido isoladas de quase todos os tecidos do corpo adulto1 , 2. além de fornecer homeostase do tecido, produzindo células residentes em caso de inflamação crônica ou lesão, eles produzem vitais citocinas e fatores de crescimento para orquestrar a angiogênese, sistema imunológico e tecido remodelação3. A interação do MSCs com tecido de câncer não é bem compreendida, mas acumula evidências sugerem que o MSCs podem promover tumor iniciação, progressão e metástase4.
A capacidade de localização de MSCs à área lesada ou cronicamente inflamada torna um candidato valioso para terapias baseadas em células-tronco. No entanto, os tecidos de câncer, “nunca cura feridas”, também liberar citocinas inflamatórias, moléculas pro-angiogênico e fatores de crescimento vitais, que atraem MSCs para a área de cancerogenous5. Embora existam limitada relatórios mostrando efeitos inibitórios do MSCs no cancro crescimento6,7, sua progressão do câncer e metástase, promovendo efeitos tem sido extensivamente relataram8. MSCs afectam directa ou indirectamente carcinogênese de maneiras diferentes, incluindo a supressão de células do sistema imunológico, secreção de fatores de crescimento/citocinas que oferecem suporte a proliferação de células cancerosas e migração, reforçar a atividade angiogênico e regulação 9,de transição epitelial-mesenquimal (EMT)10. Ambiente de tumor consiste de vários tipos de células, incluindo fibroblastos associada a câncer (CAFs) e/ou miofibroblastos, células endoteliais, adipócitos e células do sistema imunológico11. Destes, CAFs são o tipo de célula mais abundante na área do tumor que secretam várias quimiocinas promover câncer de crescimento e a metástase8. Ficou demonstrado que MSCs derivadas da medula óssea podem diferenciar em CAFs no tumor estroma12.
Células-tronco polpa dental (DPSCs), caracterizadas como os primeiros MSCs de derivado de tecido dentais por Gronthos et al . 13 em 2000 e então amplamente investigados por outros14,15, express pluripotência marcadores como Oct4, Sox2e Nanog16 e pode se diferenciar em várias células linages17. Análise de expressão de gene e proteína provou que DPSCs produzir níveis comparáveis de fatores de crescimento/citocinas com outros MSCs como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), angiogenin, fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF2), interleucina-4 (IL-4), IL-6, IL-10, e fator de células-tronco (SCF), bem como ligante de quinase-3 fms-como tirosina (Flt – 3L) que pode promover a angiogênese, modulam as células imunes e suporte câncer célula proliferação e migração18,19,20 . Enquanto as interações do MSCs com ambiente de câncer têm sido bem documentadas na literatura, a relação entre DPSCs e células de câncer não foi avaliada ainda. No presente estudo, estabelecemos estratégias de tratamento médio de co-cultura e condição para uma linhagem de células de câncer de próstata metastático altamente, PC-3 e DPSCs para propor a ação potencial do mecanismo de MSCs dentais na progressão do câncer e metástase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contribuição do MSCs para ambiente de tumor é regulada por diversas interações incluindo híbrido célula geração através de células fusões, entosis ou citocinas e chemokine atividades entre células-tronco e células de câncer28. Organização estrutural, interações célula-célula e fatores secretados determinam o comportamento de células de câncer em termos de promoção de tumor, progressão e metástase para o tecido circundante. Sistemas adequados ex vivo mod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pela Universidade de Yeditepe. Todos os dados e os dados utilizados neste artigo foram publicados anteriormente34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
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