Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия
Summary
Мы предоставляем протоколы для оценки мезенхимальных стволовых клеток, изолированных от пульпы зуба и взаимодействия клеток рака простаты на основе совместного культура прямые и косвенные методы. Состояние среды и транс ну мембраны подходят для анализа косвенных паракринными активности. Заполнение дифференциально окрашенные клетки вместе является подходящей моделью для прямого ячеек взаимодействия.
Abstract
Рак как многоэтапный процесс и сложные болезни не только регулируется отдельными пролиферации и роста, но также контролируется взаимодействия среды и ячейке опухоли. Выявление рака и взаимодействия стволовых клеток, включая изменения в внеклеточных среды, физических взаимодействий и выделяется факторы, может включить обнаружение новых вариантов терапии. Мы объединяем известных совместно культуры методов для создания модель системы мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и рак клеток взаимодействий. В текущем исследовании пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs) и PC-3 взаимодействия клеток рака простаты были рассмотрены методы прямого и косвенного Сопредседатель культуры. Состояние среды (CM), полученные из DPSCs и 0,4 мкм размера поры мембраны транс ну были использованы для изучения паракринными активности. Совместное культуры различных типов клеток вместе была выполнена для изучения взаимодействия прямых ячеек. Результаты показали, что см возросла клеточной пролиферации и снижение апоптоза в культурах клеток рака простаты. СМ и транс ну системы повышение потенциала миграции клеток PC-3 клетки. Витражи с красители разные мембраны клетки были посеяны в те же суда культуры, и DPSCs участвовали в самоорганизации структуру с PC-3 клетки при этом условии прямого сотрудничества культуры. В целом результаты показали, что методы сотрудничества культуры могут быть полезными для рака и MSC взаимодействия как модель системы.
Introduction
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК), с возможностью дифференциации и вклад регенерации мезенхимальных тканей, таких как кость, хрящ, мышцы, связки, сухожилия и жировой, были изолированы от почти всех тканей взрослого организма1 , 2. Помимо обеспечения гомеостаза ткани, производя резидентов клетки в случае хронического воспаления или травмы, они производят жизненно цитокинов и факторы роста оркестровать ангиогенеза, иммунной системы и тканей ремоделирования3. Взаимодействие MSCs с раком ткани не понятных, но накапливать данные свидетельствуют о том, что MSCs может способствовать посвящения, прогрессии и метастазированием опухоли4.
Самонаведения способность MSCs потерпевшего или хронически воспаленной области делает их ценным кандидата на основе стволовых клеток лечение. Однако рак тканей, «никогда не Исцеление ран», также релиз цитокинов, про ангиогенных молекул и жизненно важных факторов роста, которые привлекают MSCs в cancerogenous районе5. Хотя есть ограниченное отчеты, показывающие тормозящее действие MSCs на рак роста6,7, их прогрессии рака и метастазов, поощрение эффекты были широко сообщили8. MSCs, прямо или косвенно затрагивают канцерогенеза различными способами, включая подавление иммунных клеток, секретирующих факторы роста/цитокины, которые поддерживают рака пролиферации и миграции, ангиогенных активности и регулирования 9,эпителия мезенхимальных перехода (EMT)10. Опухоль среда состоит из нескольких типов клеток, включая рак связанные фибробластов (CAFs) и/или миофибробласты, эндотелиальные клетки, адипоциты и иммунные клетки11. Из них CAFs являются наиболее распространённый тип ячейки в области опухоли секретируют различные chemokines, поощрения роста и метастазирования рака8. Было показано, что производные костного MSCs могут дифференцироваться в CAFs в опухоли стромы12.
Пульпы зуба стволовых клеток (DPSCs), характеризуется как первый зубной ткани производные MSCs Gronthos и др. 13 в 2000 году и затем широко расследованы другие14,15, Экспресс плюрипотентности маркеры как Oct4, Sox2и Nanog16 и могут дифференцироваться в различные ячейки linages17. Анализ выражения генов и белков доказал, что DPSCs производить сопоставимые уровни факторов роста/цитокинов с другими MSCs Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Ангиогенин, фактор роста фибробластов 2 (FGF2), интерлейкина-4 (Ил-4), IL-6, Ил-10, и фактор стволовых клеток (SCF), а также fms как тирозин киназы-3 лиганда (Flt – 3 Л) которые могли бы способствовать ангиогенезу, модулирует иммунные клетки и поддержки раковых клеток миграции и распространения18,19,20 . В то время как взаимодействия MSCs с раком окружающей среды были хорошо документированы в литературе, отношения между DPSCs и раковые клетки не были оценены еще. В настоящем исследовании мы создали совместно культуру и состояния средство лечения стратегий линии клетки высоко метастатического рака простаты, PC-3 и DPSCs предложить возможные действия механизма стоматологических MSCs в прогрессии рака и метастаз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вклад MSCs опухоли окружающей среды регулируется ряд взаимодействия включая гибридных клеток поколения через ячейку сплавливания, entosis или цитокинов и хемокиновых деятельности между стволовых клеток и клеток рака28. Структурная организация, ячеек взаимодействий и выд?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Университет Yeditepe. Все данные и показатели, используемые в этой статье были ранее опубликованы34.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
Riferimenti
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. . Dental Stem Cells. , 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -. r., et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin’s lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -. S., Lee, H. -. Y., Kang, K. -. S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -. M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer’s disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. . Biomimetics and Stem Cells. , 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
