Endotoxins mühendislik Nanomalzemeler içinde tespiti nanomedicine alanında büyük zorluklardan biri temsil eder. Burada, nano tanecikleri potansiyel endotoksin kirlenme tahmin etmek için üç farklı biçimlerinin LAL oluşan çerçeve açıklar bir örnek çalışma mevcut.
Varsa ilaç ürünlerinde (sık sık da lipopolysaccharide denir) gram-negatif bakteri hücre duvarı bileşeni endotoksin inflamasyon, ateş, hipo – veya hipertansiyon neden olabilir ve, aşırı durumlarda olabilir doku ve organ hasarı için neden olabilir ölümcül olur. Bu nedenle, eczacılık ürünleri, endotoksin miktarda kesinlikle düzenlenmektedir. Arasında için kullanılabilen yöntemleri endotoksin algılama ve miktar, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil dünya çapında yaygın olarak kullanılır. Herhangi bir ilaç ürün LAL tahlil ile müdahale ederken, nano-formülasyonları kendi karmaşıklığı nedeniyle belirli bir meydan okuma temsil eder. Bu yazının amacı araştırmacılar endotoxins mühendislik Nanomalzemeler ve uyuşturucu nanopartikül formüle tahmininde deneyimsiz için pratik bir rehber sağlamaktır. Burada, bulanıklık, chromogenic dahil olmak üzere üç LAL biçimleri ve jel-pıhtı testleri gerçekleştirmek için pratik öneriler ele alınmıştır. Bu deneyleri endotoksin kirlenme nanoteknoloji tabanlı ilaç ürünleri, aşılar ve adjuvan belirlemek için kullanılabilir.
Bir endotoksin Ayagin Gram-negatif bakteri hücre duvarı1,2bir yapı taşıdır. Daha çok, bağışıklık hücreleri etkinleştirebilirsiniz düşük (picogram) konsantrasyonları1,2. Yanıt olarak bir endotoksin hücreleri tarafından üretilen proinflamatuar aracıların (sitokinler, lökotrienler, eikozanoidler, vb) ateş, hipotansiyon, hipertansiyon ve birden fazla organ yetmezliği gibi daha ciddi sağlık sorunları sorumlu 1 , 2 , 3. immün aracılı yan etkileri-endotoksin tarafından tetiklenen önem endotoksin kompozisyon ve yapısına göre belirlenen ve uluslararası endotoksin birimleri (IUS veya EUs)3‘ te ölçülen onun etki gücüne bağlıdır. Bu birim vücut ağırlığının kilogram başına endotoksin eşik pyrogenic doz ayarlamak için kullanılır. Bu doz intratekal rota ama tüm yolları üzerinden 5 EU/kg ilaç ürünleri için yönetilen değil. Vücut yüzeyi, göz içi sıvı, Radyofarmasötikler ve ürünleri yönetilen yolu ile intratekal rota metrekare doz uyuşturucu var 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V bir farklı eşik pyrogenic doz (V nerede birim yönetimi için tasarlanmış ürün) ve 0,2 EU/kg, sırasıyla4. Eşik pyrogenic doz için çeşitli ilaç ürünleri ve aygıtlar hakkında daha fazla bilgi sağlanır ve başka bir yerde ele4,5,6.
Hayvanlar onların duyarlılık reaksiyonları endotoksin-aracılı değişkenlik. İnsan, insan dışı primatlar ve tavşan endotoxins3‘ e en son derece hassas türler arasındadır. Hastalarda endotoksin-aracılı yan etkilerinden kaçınmak ve yanlış sonuçlara preklinik toksisite ve etkinlik çalışmaları engellemek için doğru algılamak ve her iki klinik ve önceden klinik sınıf formülasyonları endotoxins ölçmek için önemlidir. Birkaç mevcut Yöntem bu görevi elde edebilirsiniz. Yaygın olarak tüm dünyada ekran Biyomedikal ürünler bakteriyel enfeksiyonlar7,8,9algılamak için potansiyel endotoksin kirlenme de için için kullanılır Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) tahlil onlardan biri. Lysate amoebocytes hazırlanır, at nalı yengeç Limulus polyphemus kan hücreleri mevcut Kuzey Amerika7kıta Doğu kıyısında bulunan. İlginçtir, at nalı yengeçler birkaç farklı türleri vardır (Tachypleus gigas ve Tachypleus tridentatus) Asya10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) birçok Asya ülkesinde endotoksin nasıl LAL diğer cuntries10dakika sonra kullanılır benzer tespiti için kullanılır. Lysates (LAL ve TAL) etkinleştirme üzerine proteaz aktivitesi görüşmek proteinleri bir grup içerir. Bu proteinler, sözde faktör C birini endotoksin ile temas üzerine devreye girer. Aktif faktör C faktörü B, hangi sırayla da bir proteaz olur ve pıhtılaşma enzim üretmek için bir pro-pıhtılaşma enzim cleaves cleaves. Bu zincir reaksiyonların bir jel, artış örnek bulanıklık içinde ve chromogenic substrat, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic deneyleri için bir temel olarak hizmet bir renkli ürün görünümünü huzurunda oluşumu sonucudur, anılan sıraya göre. ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) açıklar için sağlanan bilgilerde açıklanan hiçbir zorunlu LAL biçimi ise sanayi belgesi, test sonuçlarını farklı LAL formatları arasında tutarsızlık durumunda karar verdi jel-pıhtı tahlil5 temel .
Çok yaygın olarak kullanılan laboratuvar kimyasalları (Örn., EDTA) ve ürünleri (Örneğin, penisilin) müdahale LAL ile bilinen ilaç deneyleri11. Girişim genellikle standart endotoksin kurtarılması, bilinen bir konsantrasyon test materyalini içeren bir çözüm içine çivili değerlendirmek tarafından tanımlanır. Spike kurtarma % 50 daha az veya fazla %200, ise o zaman LAL sonucu tahlil için verilen test materyalini inhibisyon veya geliştirme, sırasıyla4nedeniyle geçersiz. Nanoteknoloji tabanlı formülasyonları genellikle karmaşık ve LAL mekanizmaları12,13,14çeşitli engel. Girişim üstesinden gelmek için pek çok yaklaşım tarif var: örnek rekonstitüsyon özel arabellekleri ve yüzey, protein inactivation Isıtma, Isıtma ve aşırı örnekle ilave lipid tabanlı içi boş malzemeler imha tarafından divalent katyonlar5,12,13,14,15. Ne zaman LAL girişim üstesinden olamaz durumlar için alternatif yöntemler Ayrıca tarif edilmiştir: ELISA, HEK-TLR4 muhabiri hücre satır tahlil ve kütle spektrometresi16,17,18, 19.
Burada, jel-pıhtı, bulanıklık ve chromogenic LAL deneyleri yürütmek için deneysel yordamlar açıklanmıştır. Bu deneyleri de protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) Nanoteknoloji karakterizasyon Laboratuvarı (NCL) Web sitesi20 mevcuttur ve STE1.4 (chromogenic LAL). Bu aynı nano-formülasyonu karakterize etmek için en az iki farklı biçimleri yapmak için tavsiye edilir. Bulanıklık ve chromogenic LAL sonuçlarını katılmıyorum, jel-pıhtı sonuçları5kabul edilir. Ne zaman sonuçları iki LAL biçimlerinin katılmıyorum, ek çalışmalar LAL doğrulamak için monosit harekete geçirmek testi (MAT) veya tavşan pyrogen testi (RPT) kullanarak bulgulardir21yaptı. Her yöntemin endotoksin algılama için kullanılan ve pyrogenicity değerlendirme21,22,23,24avantajları ve sınırlamalar vardır unutmamak gerekir. Verilen nanoteknoloji formülasyonu karakterize etmek için kullanılan yordam sınırlamaları kabul ederek bu nano-formülasyon için en uygun yordamı kullanmak için bilimsel gerekçesi elde etmek için esastır.
Bu çalışmada, pegile liposomal doksorubisin modeli nanopartikül formülasyonu kullanıldı. Bu formülasyon 1995’te bize FDA tarafından onaylanmış ve kanser hastaları dünya çapında25tedavi etmek için kullanılır.
Bu protokol için sağlanan bilgi15,26 daha önce açıklanan ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA bize veya FDA) ve Amerika Birleşik Devletleri Pharmacopoeia (USP)4 tarafından yayımlanan farklı düzenleyici belgelere dayanan , 5 , 6 , 27ve kullanılabilir protokolleri STE1.2 (bulanıklık LAL), STE1.3 (jel-pıhtı LAL) NCL Web site…
The authors have nothing to disclose.
Çalışma federal fonların Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri, sözleşmeli HHSN261200800001E. Bu yayın içeriğini sayısı veya ilkeleri, bölümü sağlık ve insan Hizmetleri yansıtmayabilir ne ticari adlarını, ticari ürünler, söz etmez veya kuruluşların ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına.
Turbidity LAL Assay | |||
Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
Vortex | any brand | Any brand can be used | |
Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
Chromogenic LAL Assay | |||
Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
Vortex | any brand | Any brand can be used | |
Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
Gel-Clot LAL Assay | |||
LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
Vortex | any brand | Any brand can be used | |
Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |