Bicouche lipidique expérimente le Contact bulle bicouches pour Patch-colliers

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la formation des bicouches lipidiques en utilisant une méthode de bicouche contacter bulle. Une bulle d’eau est soufflée dans un solvant organique, par laquelle il se forme une monocouche à l’interface eau-huile. Deux pipettes sont manipulés pour ancrer les bulles pour former une bicouche.

Abstract

Bicouches lipidiques fournissent une plate-forme expérimentale unique pour l’étude fonctionnelle des canaux ioniques, permettant l’examen des interactions canal-membrane sous membrane diverses compositions lipidiques. Parmi eux, la double couche interface de gouttelettes a gagné en popularité ; Toutefois, la taille de la membrane large fait obstacle à l’enregistrement du bruit de fond électrique faible. Nous avons établi une méthode de bicouche (CBB) contacter bulle qui combine les avantages des bicouches lipidiques planes et méthodes de patch clamp, telles que la possibilité de varier la composition lipidique et de manipuler la mécanique de la bicouche, respectivement. En utilisant le programme d’installation pour les expériences classiques patch clamp, expériences CBB peuvent être facilement réalisées. En bref, une solution électrolytique d’une pipette de verre est soufflée dans une phase solvant organique (hexadécane), et la pression de la pipette est maintenue pour obtenir une taille de bulle stable. La bulle est spontanément bordée d’une monocouche de lipides (lipides pures ou mixtes lipides), qui est fournie à partir de liposomes dans les bulles. Ensuite, les deux bulles bordées de monocouche (~ 50 µm de diamètre) à la pointe des pipettes en verre sont amarrés pour la formation de la bicouche. Introduction de liposomes canal-reconstituée dans la bulle mène à l’intégration des canaux dans la bicouche, permettant à canal unique enregistrement actuel avec un rapport signal-bruit comparable à celle des enregistrements de patch clamp. CBBs avec une composition lipidique asymétrique sont forment facilement. Le CBB est renouvelé à plusieurs reprises de souffler les bulles précédentes et former de nouveaux. Diverses perturbations chimiques et physiques (p. ex., perfusion de membrane et la tension de la bicouche) peuvent être imposées sur le CBBs. Herein, nous présentons la procédure de base pour la formation de CBB.

Introduction

Pour les canaux ioniques, la membrane cellulaire est pas simplement un appui matériel, mais un partenaire pour générer le flux ionique. D’un point de vue fonctionnel, la membrane est un isolant électrique dans lequel ion canaux est incorporées, et toutes les membranes cellulaires sont conférés avec un potentiel de repos membranaire. Classiquement, un potentiel de membrane arbitraire a été imposé depuis un circuit externe, par lequel le courant électrique à travers les canaux a été mesuré. Cette évaluation quantitative du flux ionique à des potentiels de membrane différents a révélé les propriétés moléculaires de ces canaux, tels que leur perméabilité sélective des ions et blocage des fonctions^1,2. La plate-forme de membrane pour l’étude fonctionnelle des canaux ioniques est la membrane de la cellule ou la membrane lipidique bi-couche. Historiquement, monocanal enregistrements de courants électriques ont été créés en lipides bicouches^3,4, et les techniques pertinents ont été élaborés pour les membranes cellulaires, telles que la méthode de patch clamp (Figure 1A )^5,6. Depuis lors, ces deux techniques ont évolué séparément pour différentes fins (Figure 1)^7,8.

Lipides membranaires et membranes bicouches sont actuellement au centre de recherche pour leur rôle dans le soutien de la structure et la fonction des protéines de canal. Par conséquent, la facilité avec laquelle des méthodes pour faire varier la composition des lipides dans les bicouches est en forte demande. Lipidique bi-couche formation méthodes comme le lipidiques planes bicouche (PLB)^8,9,10,11, goutte d’eau dans l’huile bicouche¹²et gouttelettes d’une interface bicouche (DIB)^{13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} techniques (Figure 1) sont des choix communs, fournissant l’occasion d’examiner la fonction canal sous diverses compositions de lipides²⁰. Bien que le fichier DIB est techniquement plus facile à produire que la PLB conventionnelle, la grande taille du fichier DIB a créé un effet dissuasif pour les patch-colliers pour l’appliquer pour étudier les enregistrements actuels monocanal avec conductance taille habituelle (< 100 pS).

Pour contourner le bruit de fond, le domaine de la bicouche doit être minimisé. Cette question rappelle les répétitions de l’histoire dans le développement des techniques électrophysiologiques des bicouches lipidiques (Figure 1). Dans les premiers jours, une bicouche de petite taille (1 à 30 µm de diamètre) a été formée à l’extrémité de la pipette (méthode de l’immersion à bout ; Figure 1 C) ^{21 , 22 , 23}, plutôt que d’utiliser une bicouche autoportantes (~ 100 µm de diamètre) sur une cloison hydrophobe dans une chambre (Figure 1B). La méthode d’immersion à pointe autorisée pour mesures électriques avec beaucoup moins de bruit fond²⁴. Nos expériences avec le patch clamp^28,29,30, , pointe-dip^22,23,27et^25,26PLB méthodes ³¹ nous a conduit à une idée originale de former des bicouches lipidiques en utilisant les principes de la bicouche de l’eau dans l’huile. Nous avons appelé cela la bulle contact bicouche (CBB) méthode^20,32. Dans cette méthode, au lieu d’accrocher les gouttelettes d’eau dans une phase huileuse (Figure 1D), une bulle d’eau est soufflée par une pipette de verre (avec diamètre d’environ 30 µm) dans la phase huileuse (Figure 1E et 2), où le bulle est maintenue par une pression constante. Une monocouche se forme spontanément à l’interface eau-huile à la surface de la bulle. Ensuite, deux bulles sont ancrés par la manipulation de deux pipettes de verre et la bicouche est formée comme les deux monocouches approchent mutuellement, ce qui donne une superficie de bicouche d’équilibre. La taille de la bulle est contrôlée par la pression intra-bulle (maintien) et même la taille de la bicouche. Un diamètre moyen de 50 µm est fréquemment utilisé. Bien que le volume de la bulle est faible (< 100 pL), il est relié au grand volume de la solution de la pipette qui est de l’ordre du microlitre, constituant la phase électrolytique en vrac.

Il y a beaucoup d’avantages à utiliser la méthode du CBB (tableau 1). Comme une technique de formation de bicouche lipidique, membranes de diverses compositions de lipides peuvent être produites, et les membranes asymétriques sont plus facilement formé³² que ceux par les classiques de méthode pliage³³. La bicouche peut être manipulée mécaniquement, contrairement à la PLB conventionnelle qui peut seulement être pliée avec une pression hydrostatique différence^34,35. En changeant la pression d’exploitation, les bulles, soit élargir ou rétrécissement, conduisant à une augmentation ou une diminution de membrane tension³². La bicouche est mécaniquement détachable en monocouches, semblables à la cryofracture technique^36,37 des membranes dans les études morphologiques, mais avec du CBB, une manoeuvre permettant des recherches répétées détacher et attacher les cycles³² . Le faible volume de la solution d’électrolyte dans la bulle permet une fusion efficace des liposomes canal-reconstituée dans la bicouche, et la probabilité d’obtenir des enregistrements de canaux est beaucoup plus élevée avec la technique classique de PLB. Le volume de la petite bulle permet également une perfusion rapide (dans environ 20 ms) une fois une autre injection pipette est insérée dans une des bulles. Contrairement à la méthode de patch-clamp, une fois brisé, une membrane CBB est re-formée immédiatement et de manière répétée et pipettes peuvent être utilisés plusieurs fois par jour. En intégrant les avantages des méthodes PLB et patch clamp, CBB fournit une plateforme polyvalente pour faire varier les conditions physico-chimiques de la membrane, permettant des études sans précédent des interactions canal-membrane.

Avant de présenter un protocole détaillé du processus de formation CBB, l’arrière-plan physicochimique de la formation de la bicouche est présenté première, qui sera très utile pour le patch-colliers résoudre les difficultés expérimentales relatives à la formation de la membrane qui se rencontrent.

CBB expériences donnent des leçons de chimie de surface science³⁸. Le CBB est semblable à une bulle de savon, soufflée par une paille dans les airs, où même, une bulle d’eau est soufflée dans un solvant organique. On remarquera qu’une bulle d’eau est gonflée peine lorsque les lipides membranaires ne figurent pas dans la bulle d’eau ou solvant organique. En l’absence d’amphipathic lipides, la tension superficielle à une interface eau-huile est élevée, et la pression intra-bulle pour le soufflage une bulle sera élevée. Il s’agit d’une réalisation de l’équation de Laplace (ΔP = γ 2/R, où ΔP est la pression intra-bulle, γ est la tension superficielle et R est le rayon de la bulle). Lorsque la concentration de lipides dans la phase organique ou la solution d’électrolyte est élevée, augmente la densité des lipides dans la monocouche, dicté par l’isotherme d’adsorption de Gibbs (-dγ = Γ_j’ai dµ_je, où Γ_j’ai est l’excès de surface du composé i et µ_j’ai est le potentiel chimique du composant i)³⁹, conduisant à une plus faible tension superficielle et la facilité de formation de bulles. Dans le Canadian Black Book, la bicouche peut être observée sous un angle tangentiel (Figure 2), et l’angle de contact entre la monocouche et bicouche est mesurable. Cet angle représente un équilibre entre les surface tensions de la monocouche et bicouche (équation jeune : γ_bi = cos(θ)_mo γ, où γ_bi est la tension de la bicouche, γ_mo est la tension de la monocouche et θ est l’angle de contact). Les changements dans l’angle de contact indiquent des changements dans la tension de la bicouche, étant donné que la tension de la monocouche est évaluée à partir des changements dans l’angle de contact en fonction du potentiel membranaire (équation de Young-Lippmann : γ_mo = C_m V² /4 (cos (θ₀) – cos (θ_v)), où C,_m est la capacité de la membrane, V est le potentiel de membrane et θ₀ et θ_v sont les angles de contact à 0 et V mV, respectivement)^{40,41 ,},⁴². Quand deux bulles sont assez proches, ils s’approchent de l’autre spontanément. Cela est dû à la force de van der Waals, et nous pouvons observer visuellement ce processus dynamique en formation de CBB.

Un système CBB se compose de phases distinctes : à savoir, une phase d’huile en vrac, l’eau bulles recouvertes d’une monocouche et une bicouche contact (Figure 3). Elles rappellent les multiples phases observées dans une PLB, comme un tore contenant des solvants dans la phase de la bicouche et une phase organique mince en sandwich par deux monocouches^43,44. Dans le Canadian Black Book, la phase monocouche est en continuité avec le dépliant de la bicouche et molécules lipidiques diffusent facilement entre la monocouche et de la notice. La phase de monocouche couvre la majeure partie de la surface de la bulle, qui constitue la phase majeure qui sert comme un réservoir de lipides. Parce que la queue hydrophobe des lipides dans la monocouche s’étend vers l’extérieur à la phase huileuse en vrac, l’intérieur de la bicouche ou le noyau hydrophobe s’ouvre à la phase huileuse en vrac. Ainsi, une substance hydrophobe injectée dans la phase huileuse à proximité de la bicouche est en mesure d’accéder facilement à l’intérieur de la bicouche. Il s’agit de la technique de perfusion de membrane que nous avions récemment développé⁴⁵, par lequel la composition lipidique dans la bicouche est changée rapidement (moins d’une seconde) pendant monocanal enregistrements actuels. Nous avons constaté que la teneur en cholestérol dans la bicouche pourrait être réversible contrôlée par allumage et extinction⁴⁵de la perfusion de cholestérol. Dans le cas où la concentration de la substance concernée dans la monocouche et bicouche diffère, le gradient de concentration de la substance concernée est immédiatement dissous par diffusion, qui est connue comme le Marangoni effet^{46, 47}. en revanche, tongs à travers les monocouches sont lents^48,49,50.

À l’aide de la méthode CBB, la bicouche est formée dans des conditions physico-chimiques polyvalentes, comme un pH de l’électrolyte aussi bas que 1 ⁵¹, une concentration de sel (K⁺, Na⁺, etc.) jusqu’à 3 M, un potentiel de membrane atteint ±400 mV et un système température jusqu’à 60 ° c.

Il y a plusieurs options pour la formation du CBB et incorporation des molécules de canal qui y sont. Pour la formation de la monocouche à l’interface eau-huile, lipides sont ajoutés dans un solvant organique (méthode de lipide-out ; Figure 4 A, 4C) ou dans une bulle comme liposomes (méthode lipidique ; Figure 4 « B, 4D). La méthode lipides permet notamment, pour la formation des membranes asymétriques^15,32. Molécules de canal solubles en solution aqueuse (p. ex., peptides formant le chenal) sont ajoutés directement dans la bulle (Figure 4A, B)^52,53, alors que les protéines de canal sont reconstitués en liposomes, qui sont ensuite ajoutés dans la bulle (Figure 4C, D). Dans les présentes, la formation du CBBs par la méthode lipidique composant logiciel enfichable pour un peptide de canal (polytheonamide B (pTB) ; Figure 4 A) ou une protéine (canal de potassium KcsA, Figure 4C) s’affiche.

Protocol

1. préparer les Liposomes Disperser les phospholipides (p. ex., 10 mg en poudre) dans le chloroforme à une concentration souhaitée (par exemple, 10 mg/mL). Évaporer le chloroforme. Place de la solution de phospholipides dans un ballon à fond rond et la fixer sur un évaporateur rotatif (voir Table des matières) relié à une bouteille de gaz N2 . Tourner le flacon sous flux2 N à la température ambiante jusqu’à ce qu’un film mi…

Representative Results

Un typique CBB avait un diamètre de 50 µm (Figure 56) et la capacité de la membrane spécifique en hexadécane était 0,65 µF/cm2. Taille de la bulle a été arbitrairement contrôlée par la pression intra-bulle. Lorsque les petites bulles sont nécessaires pour des enregistrements de faible bruit, le diamètre de la pointe doit être proportionnellement faible. Par exemple, pour une taille de bulle de 50 µm de diamètre, le …

Discussion

La méthode CBB de formation de bicouche lipidique est basée sur le principe d’une goutte d’eau dans l’huile bordée par une monocouche²⁰. Techniquement, les procédures de formation CBBs sont faciles, surtout pour les chercheurs de patch clamp, qui sont compétents dans la manipulation des micropipettes de verre. La configuration électrophysiologique pour le patch clamp d’est facilement utilisée du CBB lors de deux manipulateurs de pipette avec microinjectors sont disponibles. D’autr…

Materials

Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
A/D Converter	Molecular Divices	Digidata1550A
Ag/AgCl electrode	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Glass Capillary	Harvard Apparatus	30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Hole Slideglass	Matsunami Glass	S339929
Inverted Microscope	Olympus	IX73
Isolation Table	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulator	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane	Nacalai	07819-32
Patch-Clamp Amplifier	HEKA	EPC800
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )	Avanti Polar Lipids	840457
Potassium Chloride	Nacalai	28514-75
Rotary Evapolator	Iwaki	REN-1000
Succinic Acid	Nacalai	32402-05
Vacuum Pump	Buchi	V-100