הכנת חרוזים2 Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO לטיהור חלבון
Summary
פרוטוקול עבור הכנת פוליפוני (pentafluorophenyl אקרילט) (חרוזים סיליקה poly(PFPA)) הושתל מוצג. לאחר מכן, השטח functionalized poly(PFPA) הוא מרותק למיטה עם נוגדנים, בעבר בהצלחה לצורך הקמת מכשול ההפרדה חלבון באמצעות immunoprecipitation.
Abstract
נדגים שיטה פשוטה להכנת פוליפוני (אקרילט pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) הושתל חרוזים סיליקה עבור קיבעון נוגדן ויישום עוקבות immunoprecipitation (IP). השטח המושתל poly(PFPA) מוכן באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים. בשלב הראשון, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) מועבר כ מולקולה מקשר על גבי המשטח סיליקה. בשלב השני, homopolymer poly(PFPA), מסונתז דרך הפיך תוספת פיצול שרשרת העברת (רפסודה) פלמור, הורכבה על המולקולה מקשר דרך התגובה החליפין בין היחידות pentafluorophenyl (PFP) פולימר וקבוצות אמין על APTES. בתצהיר של APTES ו- poly(PFPA) על סיליקה חלקיקים הם אושרה על-ידי photoelectron הספקטרומטריה (XPS), כמו גם המנוטרת על-ידי שינוי גודל החלקיקים נמדד באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). כדי לשפר את hydrophilicity משטח של החרוזים, החלפה חלקית של poly(PFPA) עם poly(ethylene glycol) functionalized-אמין (אמינו-יתד) מבוצע גם. Poly(PFPA) שהוחלפו פג הושתל סיליקה חרוזים אז מרותק למיטה עם נוגדנים עבור יישום ה-IP. להדגמה, נוגדן כנגד חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) הוא מועסק, יעילות IP נקבעת על-ידי סופג המערבי. מתוצאות הניתוח מראים כי החרוזים נוגדן. מרותק למיטה אכן יכול לשמש כדי להעשיר PKR בזמן אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיים הן מינימליות.
Introduction
מברשות פולימר תגובתי קיבלו את עניין רב בשנים האחרונות. הם יכולים לשמש כדי לשתק מולקולות פונקציונלי על חומרים אורגני או לא ליצירת משטחים מופעל עם יישומים בתחומים כמו איתור והפרדה1,2,3,4, 5. בין פולימרים תגובתי דיווח, אלה המכילים pentafluorophenyl אסתר יחידות שימושיים בעיקר בשל שלהם תגובתיות גבוהה עם אמינים והתנגדות כלפי הידרוליזה6. אחד פולימר כזה הוא poly(PFPA), זה יכול להיות בקלות functionalized שלאחר הפילמור עם מולקולות המכילות אמינים ראשית או משנית7,8,9,10. בדוגמה אחת, מברשות poly(PFPA) היו הגיבו אמינו-spiropyrans ליצירת משטחים אור מגיב7.
הכנת poly(PFPA) ושימושיה תוארו במספר הקודם פרסומים6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. בפרט, Theato ועמיתים דיווחו על הסינתזה של מברשות poly(PFPA) דרך “הרכבה כדי” וגם “הרכבה של” שיטות7,8,10,11,12 . ב “משתילים על” הגישה, מבחן פוליגרף (methylsilsesquioxane)-פולי (אקרילט pentafluorophenyl) (poly(MSSQ-PFPA)) היברידית פולימר היה מסונתז8,10,11,12. הרכיב poly(MSSQ) היה מסוגל הדבקה חזקה טופס עם מספר של משטחים אורגניים ואנאורגניים שונים, ובכך מאפשר את הרכיב poly(PFPA) ליצור שכבת מברשת על פני השטח חומרים מצופים. “משתילים מ” הגישה, משטח יזם תוספת הפיך, פיצול שרשרת העברת (סי-רפסודה) הפילמור הועסק להכין מברשות poly(PFPA)7. במקרה זה, סוכן העברת השטח שרשרת קיבוע (סי-CTA) היה הראשון covalently למצע באמצעות התגובה סיליקה-silane. קיבוע של סי-CTA ואז השתתפו סי-רפסודה פלמור של מונומרים PFPA, יצירת מברשות poly(PFPA) בצפיפות עם הצמדה קוולנטיות יציב המצע.
על ידי ניצול מברשות poly(PFPA) מסונתז באמצעות סי-רפסודה פלמור, לאחרונה להדגים את הנייח של נוגדנים על חלקיקי סיליקה poly(PFPA) הושתל ויישומם עוקבות חלבון טיהור18. השימוש poly(PFPA) מברשות נוגדן הנייח נמצאה כדי לפתור מספר בעיות הקשורות הנוכחי ההפרדה חלבון באמצעות ה-IP. IP קונבנציונאלי מסתמך על השימוש של חלבון A/G כמו מקשר (linker) נוגדן הנייח19,20,21. מאז השימוש של חלבון A/G מאפשר את הנוגדנים להיקשר עם כיוון הדפסה ספציפי, מושגת המטרה גבוהות אנטיגן התאוששות יעילות. עם זאת, השימוש של חלבון A/G סובל אינטראקציית חלבון שאינם ספציפיים, כמו גם האובדן של נוגדנים במהלך ההתאוששות חלבון, אשר שניהם תורמים רמה גבוהה של רעש רקע. כדי לפתור חסרונות אלה, crosslinking ישירה של הנוגדנים כדי תמיכה מלאה כבר בחנו22,23,24. היעילות של טכניקות אלה הוא בדרך כלל נמוך בגלל הכיוון האקראי של נוגדנים תפור. המצע poly(PFPA) הושתל, הנייח של נוגדנים הוא קבוע, מושגת באמצעות exchange התגובה בין יחידות ה-PFP ופונקציונליות אמין על נוגדנים. כיוון נוגדן אמנם עדיין אקראי, המערכת מועילה מהצורך תגובתי PFP אתרים רבים, לשליטה על ידי מידת פלמור. יתר על כן, הראינו כי על ידי החלפת חלקי של ה-PFP יחידות עם אמינו-פג, hydrophilicity פני השטח ניתן לכוונן, ושיפור היעילות התאוששות חלבון מערכת18. בסך הכל, חלקיקי סיליקה poly(PFPA) הושתל הוצגו להיות חלופה יעילה IP מסורתי עם יעילות סבירים, כמו גם הרבה רקע נקי יותר.
בתרומה זו, מדווחים שיטה חלופית כדי להכין משטח המושתל poly(PFPA) נוגדנים הנייח ויישום ה-IP. בתהליך בן שני שלבים פשוטים, כמופיע באיור 1, מולקולה מקשר APTES קודם הופקד על גבי המשטח סיליקה, ולאחר מכן הפולימר poly(PFPA) covalently מחובר המולקולה מקשר דרך התגובה בין היחידות PFP על פולימר ולפונקציה אמין על APTES. שיטת הכנה זו מאפשרת crosslinking קבוע של poly(PFPA) על משטח המצע, אך מונע סיבוכים רבים הקשורים סינתזה סי-CTA ו- SI-רפסודה פלמור של מברשות poly(PFPA). החלפה חלקית של יחידות ה-PFP עם אמינו-יתד ניתן עדיין לבצע, שמאפשר כוונון של המאפיינים משטח של מברשת פולימר. אנו מראים חרוזים סיליקה poly(PFPA) הושתל ובכך מוכן יכול להיות מרותק למיטה עם נוגדנים ונועד לשמש העשרה חלבונית דרך IP. הליך הכנת חרוזים מפורט, נוגדן הנייח, ובדיקות IP מתועדים במאמר זה, עבור הקוראים ומעוניינים אלטרנטיבה קונבנציונאלי חלבון A/G מבוסס IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
הסינתזה של poly(PFPA) הושתל SiO2 חרוזים מודגם באיור1. על ידי שימוש APTES כ מולקולה מקשר, ניתן להכין מברשות poly(PFPA) covalently הושתל. המצע2 SiO באמצעות תהליך בן שני שלבים פשוטים. למרות כמה יחידות ה-PFP מוקרבים על התגובה עם APTES, מספר גדול של יחידות ה-PFP צפויים להישאר זמינים עבור התגובה מ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות לפיתוח הגנה (מענק מס ‘ UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
