إعداد Poly(pentafluorophenyl acrylate) فونكتيوناليزيد SiO2 حبات "تنقية البروتين"
Summary
بروتوكول لإعداد بولي (بينتافلوروفينيل أكريلاتي) (poly(PFPA)) المطعمة والسليكا الخرز يرد. سطح فونكتيوناليزيد poly(PFPA) ثم المعطل تداولها مع الأجسام المضادة واستخدمت بنجاح لفصل البروتين من خلال إيمونوبريسيبيتيشن.
Abstract
ندلل على طريقة بسيطة لتحضير بولي (بينتافلوروفينيل أكريلاتي) (poly(PFPA)) المطعمة الخرز السليكا لتجميد جسم وتطبيق إيمونوبريسيبيتيشن اللاحقة (IP). يتم إعداد السطح المطعمة poly(PFPA) عن طريق عملية من خطوتين بسيطة. في الخطوة الأولى، وتودع 3-أمينوبروبيلتريثوكسيسيلاني (أبتيس) كجزيء رابط على سطح السليكا. في الخطوة الثانية، هي المطعمة بولي poly(PFPA)، تصنيعه عن طريق إضافة عكسها، وتجزئة سلسلة نقل (الطوافة) البلمرة، للجزيء رابط من خلال رد فعل التبادل بين الوحدات بينتافلوروفينيل (الشراكة من أجل السلام) على بوليمر والمجموعات أمين على أبتيس. أبتيس و poly(PFPA) على السيليكا الجسيمات هي تؤكدها مطيافية الأشعة السينية النانومترية (XPS)، فضلا عن رصد بتغير حجم الجسيمات يقاس عن طريق نثر الضوء الحيوي (DLS). تحسين hydrophilicity السطحية من الخرز، الاستعاضة الجزئية من poly(PFPA) مع poly(ethylene glycol) فونكتيوناليزيد أمين (الأمينية شماعة) يتم أيضا. Poly(PFPA) محل شماعة المطعمة والسليكا ثم هي معطلة الخرز مع الأجسام المضادة لتطبيق الملكية الفكرية. للمظاهرة، يعمل جسم مضاد ضد كيناز البروتين المنشط الحمض النووي الريبي (PKR)، وتتحدد كفاءة الملكية الفكرية النشاف الغربية. وتظهر نتائج التحليل أن الخرز جسم معطلة يمكن استخدامها في الواقع لإثراء روبية باكستانية بينما تفاعلات البروتين غير محددة الحد الأدنى.
Introduction
فرش البوليمر رد الفعل قد تلقي الكثير من الاهتمام في السنوات الأخيرة. يمكن استخدامها لشل الجزيئات الوظيفية على المواد العضوية أو غير العضوية لإنشاء الأسطح المنشط مع تطبيقات في مجالات مثل الكشف والفصل1،2،،من34، 5. بين البوليمرات المتفاعلة التي ذكرت، تلك التي تحتوي على وحدات إستر بينتافلوروفينيل مفيدة بشكل خاص سبب بهم تفاعلية عالية مع الأمينات والمقاومة تجاه التحلل6. واحد هذه البوليمرات poly(PFPA)، ويمكن أن يكون فونكتيوناليزيد سهولة البلمرة اللاحقة مع الجزيئات المحتوية على الأمينات الأولية أو الثانوية7،،من89،10. وفي أحد الأمثلة، كانت رد فعل فرش poly(PFPA) الأمينية سبيروبيرانس لإنشاء الأسطح تستجيب للضوء7.
وقد وصف إعداد poly(PFPA) وتطبيقاتها في عدد من السابقة المنشورات6،،من78،،من910،11،12 ،13،،من1415،،من1617. على وجه الخصوص، أفادت تيتو وزملاء العمل تركيب فرش poly(PFPA) عبر كل “التطعيم إلى” و “التطعيم من” أساليب7،،من810،،من1112 . في “التطعيم إلى” النهج، بولي (ميثيلسيلسيسكويوكساني)-بولي (بينتافلوروفينيل أكريلاتي) (poly(MSSQ-PFPA)) المختلطة البوليمر كان المركب8،10،،من1112. المكون poly(MSSQ) كان قادراً على شكل التصاق قوية مع عدد من الأسطح المختلفة العضوية وغير العضوية، مما يسمح لعنصر poly(PFPA) تشكل طبقة فرشاة على سطح المواد المغلفة. في “التطعيم من” النهج، بدأ سطح إضافة عكسها وتجزئة سلسلة البلمرة نقل (SI-طوف) كان يعمل على إعداد poly(PFPA) فرش7. وفي هذه الحالة، عامل نقل سلسلة المعطل تداولها سطحية (SI-كبار المستشارين التقنيين) أولاً تعلق تساهمي على الركيزة عن طريق تفاعل السليكا-سيلاني. ثم شارك المعطل تداولها SI-كبار المستشارين التقنيين في البلمرة SI-طوف من مونومرات بفبا، توليد فرش poly(PFPA) كثافة مع الروابط التساهمية مستقرة للركيزة.
باستخدام الفرش poly(PFPA) توليفها عبر البلمرة SI-طوف، أظهرنا مؤخرا تجميد الأجسام المضادة جزيئات السليكا poly(PFPA) المطعمة وتطبيقها فيما بعد في تنقية البروتين18. تم العثور على استخدام فرش poly(PFPA) لتجميد جسم لحل عدد من المسائل المرتبطة بفصل البروتين الحالية من خلال الملكية الفكرية. الملكية الفكرية التقليدية التي تعتمد على استخدام البروتين A/G كرابط لجسم التثبيت19،،من2021. حيث يتيح استخدام البروتين A/G الأجسام المضادة التي يتم إرفاقها مع اتجاه محدد، هو تحقيق الكفاءة الانتعاش مستضد الهدف السامي. ومع ذلك، استخدام البروتين A/G يعاني من التفاعل البروتين غير محددة، فضلا عن فقدان الأجسام المضادة أثناء استرداد البروتين، التي تسهم في ارتفاع مستوى الضوضاء الخلفية. وقد crosslinking المباشرة للأجسام المضادة لدعم متين لحل أوجه القصور هذه، استكشفت22،،من2324. كفاءة هذه التقنيات منخفضة عادة بسبب التوجه العشوائي للأجسام المضادة كروسلينكيد. للركيزة poly(PFPA) المطعمة، تجميد للأجسام المضادة الدائمة، يتحقق من خلال رد فعل التبادل بين وحدات الشراكة من أجل السلام ووظائف أمين على أجسام. على الرغم من اتجاه جسم لا تزال عشوائية، يستفيد النظام من وجود كثير من رد الفعل الشراكة من أجل السلام من المواقع، يمكن التحكم بدرجة البلمرة. وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن بالاستعاضة الجزئية لوحدات الشراكة من أجل السلام مع الأمينية شماعة، hydrophilicity السطحية يمكن ضبطها، مواصلة تحسين كفاءة نظام18استرداد البروتين. عموما، عرضت جزيئات السليكا المطعمة poly(PFPA) أن يكون بديل فعال للملكية الفكرية التقليدية بكفاءة معقولة، فضلا عن خلفية أنظف كثيرا.
في هذه المساهمة، يمكننا تقرير طريقة بديلة لإعداد سطح المطعمة poly(PFPA) لتجميد جسم وتطبيق الملكية الفكرية. في عملية من خطوتين بسيطة، كما هو مبين في الشكل 1، جزيء رابط أبتيس هو أولاً المودعة على سطح السليكا، ثم البوليمر poly(PFPA) تساهمي موصولة إلى جزيء رابط من خلال التفاعل بين وحدات الشراكة من أجل السلام على بوليمر ومهام أمين على أبتيس. هذا الأسلوب إعداد يسمح ل crosslinking الدائم من poly(PFPA) على سطح الركازة، لكن تجنب كثير من المضاعفات المرتبطة مع توليف SI-كبار المستشارين التقنيين والبلمره SI-طوف من فرش poly(PFPA). لا تزال تتم الاستعاضة الجزئية لوحدات الشراكة من أجل السلام مع الأمينية شماعة، السماح لصقل الخصائص السطحية فرشاة البوليمر. نعرض الخرز السليكا المطعمة poly(PFPA) وهكذا أعد يمكن المعطل تداولها مع الأجسام المضادة وتستخدم لتخصيب البروتين عن طريق الملكية الفكرية. الإجراء إعداد حبة مفصلة وتجميد جسم، واختبار الملكية الفكرية موثقة في هذه المقالة، للقراء المهتمين في البحث عن بديل للبروتين التقليدية A/G القائمة على الملكية الفكرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توليف poly(PFPA) المطعمة SiO2 حبات يتضح في الشكل 1. باستخدام أبتيس كجزيء رابط، يمكن إعداد فرش poly(PFPA) تساهمي المطعمة ب SiO2 الركيزة عن طريق عملية من خطوتين بسيطة. على الرغم من أن بعض الوحدات الشراكة من أجل السلام هي التضحية للتفاعل مع أبتيس، عدد كبير من الوحدات الشراكة من أ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها الوكالة “تطوير الدفاع” (رقم المنحة UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
