Forberedelse af Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 perler for Protein oprensning
Summary
En protokol til forberedelse af poly (pentafluorophenyl acrylat) (poly(PFPA)) podet silica perler er præsenteret. Poly(PFPA) functionalized overflade er derefter immobiliseret med antistoffer og anvendt med succes til protein adskillelse gennem immunoprecipitation.
Abstract
Vi demonstrere en enkel metode til at forberede poly (pentafluorophenyl acrylat) (poly(PFPA)) podet silica perler for antistof immobilisering og efterfølgende immunoprecipitation (IP) program. Den podede poly(PFPA) overflade er forberedt via en simpel to-trins proces. I det første trin, er 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) deponeret som en linker molekyle overfladen, silica. I andet trin af poly(PFPA) homopolymer, syntetiseres via reversible addition og fragmentering kæde overførsel (TØMMERFLÅDE) polymerisering, er podet til linker molekyle gennem exchange reaktion mellem pentafluorophenyl (PFP) enheder på den polymer og amine grupper på APTES. Aflejring af APTES og poly(PFPA) på silica partikler er bekræftet af X-ray photoelectron spektroskopi (XPS), samt overvåges af partikel størrelse ændring målt via dynamisk lysspredning (DLS). For at forbedre den overflade hydrofiliciteten af perler, delvise substitution af poly(PFPA) med Amin-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PLØK) udføres også. Den PIND-substituerede poly(PFPA) podet silica perler er derefter immobiliseret med antistoffer for IP ansøgningen. For demonstration, et antistof mod protein kinase RNA-aktiveret (PKR) er ansat og IP er bestemt af Western blotting. Analyseresultaterne viser, at antistof immobiliseret perler faktisk kan bruges til at berige PKR, mens uspecifikke protein interaktioner er minimal.
Introduction
Reaktiv polymer pensler har modtaget megen interesse i de seneste år. De kan bruges til at immobilisere funktionelle molekyler på uorganiske eller organiske materialer til at skabe aktiveret overflader med applikationer på områder som afsløring og adskillelse1,2,3,4, 5. Blandt de reaktive polymerer rapporteret, er dem, der indeholder pentafluorophenyl ester enheder især nyttigt på grund af deres høje reaktivitet med aminer og modstand mod hydrolyse6. En sådan polymer er poly(PFPA), og det kan være let functionalized efter polymerisering med molekyler, der indeholder primære eller sekundære aminer7,8,9,10. I et eksempel, var poly(PFPA) pensler reagerede med amino-spiropyrans til at skabe lys-responderende overflader7.
Forberedelse af poly(PFPA) og dens anvendelse er blevet beskrevet i en række tidligere publikationer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. Især rapporterede Theato og kollegaer syntesen af poly(PFPA) pensler via både “podning til” og “podning fra” metoder7,8,10,11,12 . I “podning til” tilgang, en poly (methylsilsesquioxane)-poly (pentafluorophenyl acrylat) (poly(MSSQ-PFPA)) hybrid polymer blev syntetiseret8,10,11,12. Komponenten poly(MSSQ) kunne form stærk vedhæftning med en række forskellige organiske og uorganiske overflader, således at poly(PFPA) komponent til at danne en børste lag på den coatede materiale overflade. I “podning fra” tilgang, overflade indledt reversible tilsætning og fragmentering kæde overførsel (SI-TØMMERFLÅDE) polymerisering var ansat til at forberede poly(PFPA) pensler7. I dette tilfælde blev en overflade immobiliseret kæde transfer agent (SI-CTA) først kovalent knyttet til underlaget via silica-silan reaktion. Immobiliseret SI-CLU deltog derefter i SI-TØMMERFLÅDE polymerisering af PFPA monomerer, genererer tæt pakket poly(PFPA) pensler med stabil kovalente kobling til underlaget.
Ved at udnytte poly(PFPA) pensler syntetiseres via SI-TØMMERFLÅDE polymerisering, viste vi for nylig immobilisering af antistoffer på poly(PFPA) podet silica partikler og deres efterfølgende anvendelse i protein oprensning18. Brugen af poly(PFPA) pensler til antistof immobilisering blev fundet til at løse en række problemer forbundet med aktuelle protein adskillelse gennem IP. Konventionelle IP er baseret på brugen af Protein A/G som en linker til antistof immobilisering19,20,21. Da brugen af Protein A/G giver antistoffer til at være forbundet med en bestemt orientering, er højt mål antigen nyttiggørelse effektivitet opnået. Men brugen af Protein A/G lider af ikke-specifik protein interaktion samt tab af antistoffer under protein opsving, som begge bidrager til et højt niveau af baggrundsstøj. Du kan løse disse mangler ved har direkte crosslinking af antistoffer mod en solid støtte været udforsket22,23,24. Effektiviteten af sådanne teknikker er typisk lav på grund af den tilfældige orientering af crosslinked antistoffer. For poly(PFPA) podet substrat er immobilisering af antistoffer permanent, opnået gennem exchange reaktion mellem PFP enheder og Amin funktionaliteter på antistoffer. Selvom antistof orientering er stadig tilfældig, systemet nyder godt af at have mange reaktive PFP websteder, styres af graden af polymerisering. Desuden, vi viste, at af delvise substitution af PFP enheder med amino-PEG, overflade hydrofiliciteten kan indstilles, yderligere forbedre protein opsving effektivitet af systemet18. Samlet set blev poly(PFPA) podet silica partikler vist sig at være et effektivt alternativ til traditionel IP med rimeligt energieffektivitet samt meget renere baggrund.
I dette bidrag rapporterer vi en alternativ metode til at forberede antistof immobilisering og IP ansøgningen poly(PFPA) podede overflade. I en simpel to-trins proces, som illustreret i figur 1, en APTES linker molekyle er først deponeres overfladen, silica, så poly(PFPA) polymer er kovalent knyttet til linker molekyle ved reaktion mellem PFP enheder på den polymer og Amin funktioner på APTES. Denne forberedelse metode giver mulighed for den permanente crosslinking af poly(PFPA) til et substrat overflade, men undgår mange komplikationer forbundet med SI-CTA syntese og SI-TØMMERFLÅDE polymerisering af poly(PFPA) børster. Delvise substitution af PFP enheder med amino-PIND kan stadig udføres, giver mulighed for finjustering af polymer børste overfladen egenskaber. Vi viser poly(PFPA) podet silica perlerne således forberedt kan immobiliseret med antistoffer og anvendes til protein berigelse via IP. Detaljerede perle forberedelse procedure, antistof immobilisering og IP test er dokumenteret i denne artikel, for læserne interesseret i søger et alternativ til konventionelle Protein A/G baseret IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syntesen af poly(PFPA) podet SiO2 perler er illustreret i figur 1. Ved at ansætte APTES som en linker molekyle, kan poly(PFPA) børster kovalent podet til SiO2 substrat forberedes via en simpel to-trins proces. Selv om nogle af PFP enheder er ofret for reaktionen med APTES, forventes et stort antal PFP enheder skal forblive tilgængelig for senere reaktion med enten amino-PIND eller antistoffer. PFP-grupper er kendt for at danne lavenergi overflader, så poly(PFPA) bø…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af agenturet for forsvar udvikling (Grant nr. UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
