Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO2 parels eiwitreiniging
Summary
Een protocol voor de bereiding van poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(PFPA)) geënt silica kralen wordt gepresenteerd. Vervolgens wordt het functionalized oppervlak van poly(PFPA) geïmmobiliseerd met antilichamen en met succes gebruikt voor de scheiding van de eiwitten door middel van immunoprecipitation.
Abstract
We laten zien een eenvoudige methode om te bereiden poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(PFPA)) geënt silica kralen voor antilichaam immobilisatie en latere immunoprecipitation (IP)-toepassing. Het poly(PFPA) geënte oppervlak is bereid via een eenvoudige stappen. In de eerste stap, wordt 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) gestort als een linker molecuul op het oppervlak van siliciumdioxide. In de tweede stap, poly(PFPA) homopolymeer, gesynthetiseerd via de omkeerbare toevoeging en versnippering keten overdracht (vlot) polymerisatie, aan de linker molecule door de reactie van de uitwisseling tussen de eenheden pentafluorfenyl (PFP) is geënt op de polymeer en de amine groepen op APTES. De afzetting van APTES en poly(PFPA) op de silica deeltjes zijn bevestigd door X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), evenals gecontroleerd door het deeltje grootte aanpast gemeten via Dynamische lichtverstrooiing (DLS &). Om de oppervlakte hydrophilicity van de parels, de gedeeltelijke vervanging van de poly(PFPA) met poly(ethylene glycol) amine-matiemaatschappij (amino-PEG) wordt ook uitgevoerd. De PEG-gesubstitueerde poly(PFPA) geënt silica kralen zijn vervolgens geïmmobiliseerd met antilichamen voor IP-applicatie. Een antilichaam tegen proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) is werkzaam voor demonstratie, en IP-efficiëntie wordt bepaald door het westelijke bevlekken. De resultaten van de analyse weergeven dat het antilichaam geïmmobiliseerd kralen inderdaad kunnen worden gebruikt voor het verrijken van PKR, terwijl niet-specifieke eiwitinteractie minimaal zijn.
Introduction
Reactieve polymeren borstels hebben veel belangstelling in de afgelopen jaren ontvangen. Ze kunnen worden gebruikt om te immobiliseren functionele moleculen op organische of anorganische materialen maken van geactiveerde oppervlakken met applicaties op gebieden zoals opsporing en scheiding1,2,3,4, 5. Onder de reactieve polymeren gemeld, zijn die met pentafluorfenyl ester eenheden vooral handig als gevolg van hun hoge reactiviteit met amines en weerstand tegen hydrolyse6. Één dergelijke polymeer is poly(PFPA) kan, en het gemakkelijk matiemaatschappij na polymerisatie met moleculen bevat primaire of secundaire amines7,,8,,9,10. In een voorbeeld, waren poly(PFPA) borstels reageerde met amino-spiropyrans maken van licht-responsieve oppervlakken7.
De voorbereiding van de poly(PFPA) en haar toepassingen zijn beschreven in een aantal eerdere publicaties6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. In het bijzonder rapporteerden Theato en medewerkers de synthese van poly(PFPA) borstels via zowel “enten te” en “enten van” methoden7,8,10,11,12 . In de “enten te” aanpak, een poly (methylsilsesquioxaan)-poly (pentafluorfenyl acrylaat) (poly(MSSQ-PFPA)) hybride polymeer was gesynthetiseerde8,10,11,12. De poly(MSSQ)-component was in staat om de sterke adhesie van de vorm met een aantal verschillende organische en anorganische oppervlakken, waardoor het poly(PFPA) onderdeel vormen van een borstel-laag op het gecoate oppervlak van materiaal. In de “enten van” aanpak, oppervlak geïnitieerd omkeerbare toevoeging en versnippering keten overdracht (SI-vlot) polymerisatie te bereiden poly(PFPA) borstels7werkzaam was. In dit geval, was een agent van de postoverdracht oppervlakte geïmmobiliseerdet keten (SI-CTA) eerst covalent gekoppeld aan het substraat via silica-silane reactie. De geïmmobiliseerdet SI-CTA deelgenomen vervolgens in de SI-vlot polymerisatie van PFPA monomeren, genereren van dichtbevolkte verpakte poly(PFPA) borstels met stabiele covalente verbinding met het substraat.
Door gebruik te maken van de borstels van de poly(PFPA) gesynthetiseerd via SI-vlot polymerisatie, we onlangs aangetoond de immobilisatie van antilichamen op de poly(PFPA) geënt silica deeltjes en hun latere toepassing in eiwit zuivering18. Het gebruik van poly(PFPA) borstels voor antilichaam immobilisatie werd gevonden voor het oplossen van een aantal kwesties in verband met de huidige eiwit scheiding via IP. Conventionele IP is afhankelijk van het gebruik van eiwitten A/G als een linker voor antilichaam immobilisatie19,20,21. Aangezien het gebruik van eiwitten A/G de antilichamen worden verbonden met een specifieke oriëntatie toestaat, wordt hoge doel antigeen herstelcapaciteit bereikt. Echter, het gebruik van eiwitten A/G lijdt aspecifieke eiwit interactie evenals het verlies van antistoffen tijdens het herstel van de eiwitten, die beide tot een hoog niveau van achtergrondgeluiden bijdragen. U kunt oplossen door deze tekortkomingen, is directe crosslinking van de antilichamen aan een stevige steun onderzocht22,23,24. De efficiëntie van deze technieken is meestal minder intensief als gevolg van de willekeurige oriëntatie van de kruisverwijzende antilichamen. Voor de poly(PFPA) geënt substraat is de immobilisatie van antilichamen blijvend, bereikt door middel van uitwisseling reactie tussen PfP-eenheden en amine functionaliteiten op antilichamen. Hoewel de antilichaam-oriëntatie nog steeds willekeurig is, profiteert het systeem met vele reactieve PfP-sites, controleerbaar door de mate van polymerisatie. Bovendien toonden we die door de gedeeltelijke vervanging van PfP-eenheden met amino-PEG, oppervlakte hydrophilicity kan worden afgestemd, verdere verbetering van de herstelcapaciteit van de eiwitten van de systeem-18. Over het geheel genomen bleken de poly(PFPA) geënt silica deeltjes een effectief alternatief voor traditionele IP met redelijke efficiëntie alsmede veel schoner achtergrond.
In deze bijdrage rapporteren we een alternatieve methode voor te bereiden op poly(PFPA) geënte oppervlak antilichaam immobilisatie en IP-applicatie. In eenvoudige stappen, zoals wordt geïllustreerd in Figuur 1, een APTES linker molecuul wordt eerst gestort op het oppervlak van silica, dan het poly(PFPA) polymeer is covalent gekoppeld aan de linker molecule door de reactie tussen de PfP-eenheden op de polymeer en de amine functies op APTES. Deze voorbereiding methode zorgt voor de permanente crosslinking van poly(PFPA) aan de oppervlakte van een substraat, maar vermijdt de vele complicaties geassocieerd met SI-CTA synthese en SI-vlot polymerisatie van poly(PFPA) borstels. Gedeeltelijke vervanging van de PfP-eenheden met amino-PEG kan nog steeds worden uitgevoerd, waardoor “fine-tuning” van het polymeer borstel oppervlakte-eigenschappen. Laten we de poly(PFPA) geënt silica kralen dus bereid kunnen worden geïmmobiliseerd met antilichamen en kan worden gebruikt voor eiwitverrijking via IP. De gedetailleerde kraal voorbereiding procedure, antilichaam immobilisatie en IP-testen worden beschreven in dit artikel, voor lezers die geïnteresseerd zijn in het zoeken naar een alternatief voor conventionele eiwit A/G op basis van IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
De synthese van poly(PFPA) geënt SiO2 kralen wordt geïllustreerd in Figuur 1. Door APTES als een linker-molecuul, kunnen poly(PFPA) borstels covalent geënt op SiO2 substraat bereid worden via een eenvoudige stappen. Hoewel sommige van de PfP-units worden opgeofferd voor de reactie met APTES, een groot aantal van de PfP-eenheden naar verwachting blijven beschikbaar voor latere reactie met amino-PEG of antilichamen. De PfP-groepen staan bekend om te vormen van de lage …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Agentschap voor ontwikkeling defensie (Grant nr. UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
