단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO2 구슬의 준비
Summary
폴 리 (pentafluorophenyl 아크릴)의 준비에 대 한 프로토콜 (poly(PFPA)) 융합 실리 카 비즈 제공 됩니다. Poly(PFPA) 기능성된 표면 다음 항 체와 함께 움직일 하 고 immunoprecipitation 통해 단백질 분리에 대 한 성공적으로 사용.
Abstract
폴 리 (pentafluorophenyl 아크릴)을 준비 하는 간단한 방법을 보여 줍니다 (poly(PFPA)) 융합 항 체 동원 정지 및 후속 immunoprecipitation (IP) 응용 프로그램에 대 한 실리 카 구슬. 간단한 2 단계 프로세스를 통해 poly(PFPA) 이식할된 표면 준비 된다. 첫 번째 단계에서 3-aminopropyltriethoxysilane (항)으로 링커 분자 실리 카 표면에 입금 됩니다. 두 번째 단계에서 poly(PFPA) 단일 중합체, 가역 추가 및 조각화 체인 전송 (뗏목) 중 합을 통해 합성에 pentafluorophenyl (PFP) 단위 사이 교환 반응을 통해 링커 분자에 투입 되는 폴리머와 항에 아민 그룹입니다. 항 및 실리 카 입자는 엑스레이 광전자 분광학 (XPS)에 의해 확인으로 입자 크기 변화에 의해 감시에 poly(PFPA)의 증 착 동적 산란 (DL)을 통해 측정. 구슬, 아민 기능성된 poly(ethylene glycol)와 poly(PFPA)의 부분 대체의 표면 화란 개선 (아미노 PEG)도 수행 됩니다. 못 대체 poly(PFPA) 실리 카 구슬 다음 IP 응용 프로그램에 대 한 항 체와 함께 움직일 수 투입. 데모, 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)에 대 한 항 체, 고용 및 IP 효율 서쪽 blotting에 의해 결정 됩니다. 분석 결과 항 체 움직일 구슬 실제로 일반적인 단백질 상호 작용은 최소 PKR을 풍부 하 게 사용 될 수 있다는 것을 보여준다.
Introduction
반응성 폴리머 브러쉬 최근 몇 년 동안에 많은 관심을 받았습니다. 활성화 된 표면 탐지 및 분리1,2,3,4,등의 분야에서 응용 프로그램과 함께 만드는 유기 또는 무기 재료에 기능성 분자를 고정을 사용할 수 있습니다. 5. 보고 반응 고분자 중 pentafluorophenyl 에스테 르 단위를 포함 하는 아민 및 가수분해6향해 저항 그들의 높은 반응성 때문에 특히 유용 합니다. 이러한 한 폴리머 poly(PFPA), 이며 1 차 또는 2 차 아민7,8,,910를 포함 하는 분자와 쉽게 기능성된 후 중 합 될 수 있습니다. 한 예로, poly(PFPA) 브러쉬 빛 반응 표면7만들려고 아미노 spiropyrans로 반응 했다.
Poly(PFPA)와 그 응용 프로그램의 준비 이전 간행물6,7,,89,10,11,12의 숫자에 설명 되었습니다. ,13,,1415,,1617. 특히, Theato와 동료 보고 “에 접목”와 “에서” 방법7,,810,,1112 접목을 통해 poly(PFPA) 브러쉬의 합성 . “접목 에” 접근 방식, 폴 리 (methylsilsesquioxane)에서-폴 리 (pentafluorophenyl 아크릴) (poly(MSSQ-PFPA)) 하이브리드 폴리머 합성된8,10,,1112했다. Poly(MSSQ) 구성 요소 형태로 강한 접착 코팅된 소재 표면에 브러시 레이어를 형성 하는 poly(PFPA) 구성 요소 되므로 다른 유기 및 무기 표면 수가 있었습니다. “접목 에서” 접근에서 표면 가역 추가 시작 하 고 조각화 체인 전송 (SI-뗏목) 중 합 poly(PFPA) 브러쉬7을 준비 하기 위해 고용 되었다. 이 경우에, 표면 고정된 체인 전송 에이전트 (SI-CTA) covalently silane 실리 카 반응을 통해 기판에 첨부를 먼저 되었다. 고정된 시 CTA 다음 기판에 안정적인 공유를 밀도가 포장된 poly(PFPA) 브러쉬 생성 PFPA 단위체의 뗏목 시 합에 참가 했다.
시-뗏목 중 합을 통해 합성 poly(PFPA) 브러쉬를 이용 하 여 우리는 최근 poly(PFPA) 융합 실리 카 입자와 단백질 정화18에서 그들의 후속 응용 프로그램에 항 체의 동원 정지를 시연. 항 체의 동원 정지에 대 한 poly(PFPA) 브러쉬를 사용 하 여 다양 한 IP 통해 현재 단백질 분리와 관련 된 문제를 해결 하기 위해 발견 되었다. 기존의 IP 항 체 immobilization19,,2021단백질 A/G는 링커로의 사용에 의존합니다. 이후 단백질 A/G를 사용 하 여 항 체를 특정 방향으로 장착할 수, 높은 대상 항 원 복구 효율성 달성 된다. 그러나, 단백질 A/G를 사용 하 여 단백질 복구, 둘 중 배경 잡음의 높은 수준에 기여 하는 동안 일반적인 단백질 상호 작용 뿐만 아니라 항 체의 손실에서 겪고 있다. 이러한 단점을 해결 하려면 고체 지원에 항 체의 직접 가교 탐험된22,,2324되었습니다. 이러한 기술의 효율은 일반적으로 낮은 가교 된 항 체의 임의의 방향으로. Poly(PFPA) 투입 기판에 대 한 항 체의 동원 정지는 영구적, PFP 단위 및 항 체에 아민 기능 사이 교환 반응을 통해 달성입니다. 비록 항 체 오리엔테이션은 여전히 무작위, 시스템 많은 반응 PFP 사이트, 중 합도 의해 제어 하는 데에서 혜택. 또한, 우리 아미노-말뚝와 PFP 단위의 부분 대체 하 여 보여주는 표면 화란 수 수 조정, 추가 시스템18의 단백질 복구 효율성을 향상. 전반적으로, poly(PFPA) 융합 실리 카 입자 합리적인 효율성 뿐만 아니라 많은 청소기 배경 전통적인 ip 효과적인 대안이 될를 표시 했다.
이 기여에 우리는 poly(PFPA) 이식할된 표면 항 체 동원 정지 및 IP 응용 프로그램에 대 한 준비 하는 다른 방법을 보고 합니다. 간단한 2 단계 프로세스에 그림 1에서 볼 수 있듯이 항 링커 분자는 먼저 입금 실리 카 표면에 그 후에 poly(PFPA) 폴리머 covalently에 PFP 단위 사이 반응을 통해 링커 분자에 연결 된 고분자 고 항에 아민 기능입니다. 이 준비 방법은 기판 표면에 poly(PFPA)의 영구 가교에 대 한 수 있지만 시 CTA 합성 및 poly(PFPA) 브러쉬의 중 합 시-뗏목과 관련 된 많은 합병증을 피 한다. 아미노 페그와 PFP 단위의 부분 대체 여전히 수행할 수 있습니다, 고분자 브러쉬 표면 특성의 미세 조정 허용. 우리는 따라서 준비 poly(PFPA) 융합 실리 카 구슬 항 체와 함께 움직일 수 및 IP 통해 단백질 농축 사용할 수 보여줍니다. 자세한 비드 준비 절차, 항 체 immobilization, 그리고 IP 테스트이 문서에 설명 되어 있습니다, 그리고 추구에 관심이 있는 독자에 대 한 기존의 단백질 A/G 대신 IP 기반.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poly(PFPA)의 합성 SiO2 구슬은 그림 1에 나와 있는 투입. 채용 함으로써 항으로 링커 분자, poly(PFPA) 브러쉬 covalently SiO2 기판에 투입 간단한 2 단계 프로세스를 통해 준비 될 수 있습니다. PFP 단위 중 일부 항에 대 한 반응에 대 한 희생은, 비록 많은 PFP 단위 아미노 말뚝 또는 항 체 이상 반응에 대 한 사용할 수 있는 예상 된다. PFP 그룹 poly(PFPA) 브러쉬 할 물<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 국방 개발 (부여 번호에 대 한 기관에 의해 지원 되었다 UD170039ID)입니다.
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
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