Utarbeidelse av Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 perler for Protein rensing
Summary
En protokoll for utarbeidelse av poly (pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) podet silica perler er presentert. Poly(PFPA) functionalized overflaten er så immobilisert med antistoffer og brukt med hell i protein separasjon gjennom immunoprecipitation.
Abstract
Vi viser en enkel metode for å forberede poly (pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) podet silica perler for antistoff immobilisering og påfølgende immunoprecipitation (IP) program. Poly(PFPA) podet overflaten forberedes via en enkel prosess. I det første trinnet, settes 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) inn som et koblingsfunksjonalitet molekyl på silica overflaten. I det andre trinnet er poly(PFPA) homopolymer, syntetisert via reversibel tillegg og fragmentering kjeden overføring (FLÅTEN) polymerisasjon, podet til koblingsfunksjonalitet molekylet gjennom exchange reaksjonen pentafluorophenyl (PFP)-enheter på den polymer og Amin gruppene i APTES. Avsetning av APTES og poly(PFPA) på silika partikler er bekreftet av X-ray photoelectron spektroskopi (XPS), samt overvåket av partikkel størrelse endringen målt via dynamisk lysspredning (DLS). Forbedre den overflaten hydrophilicity av perler, delvis substitusjon av poly(PFPA) med Amin-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) er også utført. PEG-substituert poly(PFPA) podet silica perler er så immobilisert med antistoffer for IP-programmet. For demonstrasjon, et antistoff mot protein kinase RNA-aktivert (PKR) er ansatt og IP effektivitet bestemmes av vestlige blotting. Analyseresultatene viser at antistoff immobilisert perlene kan faktisk brukes til å berike PKR mens uspesifisert protein interaksjoner er minimal.
Introduction
Reaktiv polymer børster har mottatt stor interesse i de senere år. De kan brukes til nakkens funksjonelle molekyler på organisk eller uorganisk materiale å lage aktivert overflater med programmer innenfor områder som gjenkjenning og separasjon1,2,3,4, 5. Blant de reaktive polymerer rapportert, er som inneholder pentafluorophenyl ester enheter spesielt nyttig på grunn av deres høye kryssreaksjon med aminer og motstand mot hydrolyse6. En slik polymer er poly(PFPA), og det kan være lett functionalized etter polymerisasjon med molekyler som inneholder primære eller sekundære aminer7,8,9,10. I ett eksempel var poly(PFPA) børster reagert med amino-spiropyrans å lage lys svarer overflatene7.
Utarbeidelse av poly(PFPA) og tilhørende programmer er beskrevet i flere tidligere publikasjoner6,7,8,9,10,11,12 ,,13,,14,,15,,16,,17. Spesielt rapporterte Theato og medarbeidere syntese av poly(PFPA) børster via både “pode til” og “pode fra” metoder7,8,10,11,12 . I den “pode å” tilnærming, en poly (methylsilsesquioxane)-poly (pentafluorophenyl acrylate) (poly(MSSQ-PFPA)) hybrid polymer ble syntetisert8,10,11,12. Komponenten poly(MSSQ) kunne skjemaet sterk vedheft med en rekke ulike organiske og uorganiske overflater, slik at poly(PFPA) komponenten til en pensel laget på bestrøket materialoverflaten. I den “pode fra” tilnærming, overflate initiert reversibel tillegg og fragmentering kjeden overføring (SI-FLÅTEN) polymerisasjon var ansatt å forberede poly(PFPA) børster7. I dette tilfellet ble en overflate immobilisert kjeden forflytning agent (SI-CTA) først covalently knyttet til underlaget via silika-silane reaksjon. Immobilisert SI-CTA deltok i SI-FLÅTEN polymerisasjon av PFPA monomerer, genererer tettpakkede poly(PFPA) børster stabil kovalente kobling til underlaget.
Ved å benytte poly(PFPA) børster syntetisert via SI-FLÅTEN polymerisasjon, viste vi nylig immobilisering av antistoffer poly(PFPA) podet silika partikler og deres anvendelse i protein rensing18. Bruk av poly(PFPA) børster for antistoff immobilisering fant for å løse mange problemer forbundet med dagens protein skille gjennom IP. Konvensjonelle IP er avhengig av bruken av Protein A/G som et linker for antistoff immobilisering19,20,21. Siden bruken av Protein A/G kan antistoffer skal festes i en bestemt retning, er høye målet antigen utvinning effektivitet oppnådd. Men lider bruk av Protein A/G av ikke-spesifikk protein samhandling samt tap av antistoffer under protein utvinning, begge bidrar til høy bakgrunnsstøy. Du kan løse disse svakhetene ved har direkte crosslinking av antistoffer mot en solid støtte vært utforsket22,23,24. Effektiviteten av slike teknikker er vanligvis lav på grunn av tilfeldig orienteringen av krysskoblet antistoffer. Av poly(PFPA) podet underlaget er immobilisering av antistoffer permanent, oppnådd gjennom exchange reaksjon mellom PFP enheter og Amin funksjonaliteten på antistoffer. Selv om antistoff retningen er fortsatt tilfeldig, fordeler systemet av å ha mange reaktive PFP områder, kontrollerbar av graden av polymerisasjon. Videre vi viste at ved delvis substitusjon av PFP enheter med amino-pinne, overflate hydrophilicity stilles, ytterligere forbedre protein utvinning effektiviteten av systemet18. Samlet ble poly(PFPA) podet silika partikler vist å være et effektivt alternativ til tradisjonelle IP med rimelig effektivitet samt mye renere bakgrunnen.
I denne bidrag rapportere vi en alternativ metode å forberede poly(PFPA) podet overflaten antistoff immobilisering og IP søknad. I en enkelt prosess, som vist i figur 1, en APTES koblingsfunksjonalitet molekyl er først avsatt på silica overflaten, så poly(PFPA) polymer er covalently knyttet til koblingsfunksjonalitet molekylet gjennom reaksjonen PFP enhetene på den polymer og Amin funksjonene på APTES. Denne forberedelse metoden tillater permanent crosslinking av poly(PFPA) til et substrat overflate, men unngår mange komplikasjoner knyttet til SI-CTA syntese og SI-FLÅTEN polymerisering av poly(PFPA) børster. Delvis substitusjon av PFP-enheter med amino-pinne kan fremdeles utføres, slik at finjustering av polymer børste overflaten egenskapene. Vi viser poly(PFPA) podet silica perlene dermed forberedt kan immobilisert med antistoffer og brukt for protein berikelse IP. Den detaljerte perle forberedelse prosedyren antistoff immobilisering og IP testing er dokumentert i denne artikkelen, for leserne interessert i søker et alternativ til konvensjonelle Protein A/G basert IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syntese av poly(PFPA) podet SiO2 perler er illustrert i figur 1. Ved å bruke APTES som et koblingsfunksjonalitet molekyl, kan poly(PFPA) børster covalently podet til SiO2 underlaget tilberedes via en enkel prosess. Selv om noen av PFP enhetene er ofret for reaksjon med APTES, er et stort antall PFP enhetene forventet å være tilgjengelig for senere reaksjon med amino-pinne eller antistoffer. PFP-grupper er kjent til lav energi overflater poly(PFPA) børster gjøre ik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av byrået for Defense utvikling (Grant nr. UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. On-chip immunoprecipitation for protein purification. Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al. Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes. Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
