Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO2 cuentas para purificación de proteínas
Summary
Un protocolo para la preparación de poli (acrilato del pentafluorophenyl) (granos de sílice poly(PFPA)) injertado se presenta. La superficie de poly(PFPA) funcionalizados es inmovilizada con anticuerpos y utilizada con éxito para la separación de proteínas por inmunoprecipitación.
Abstract
Demostrar un método simple para preparar polivinílico (acrilato del pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) injertado granos de sílice para la inmovilización de anticuerpos y aplicación posterior de inmunoprecipitación (IP). La superficie injertada poly(PFPA) es preparada mediante un proceso de dos pasos simples. En el primer paso, 3 aminopropyltriethoxysilane (APTES) se deposita como una molécula de vinculador en la superficie de la sílice. En el segundo paso, poly(PFPA) homopolímero, sintetizado mediante la adición reversible y fragmentación cadena transferencia (balsa) la polimerización, se injerta a la molécula del vinculador mediante la reacción de intercambio entre las unidades del pentafluorophenyl (PFP) en el polímero y los grupos de la amina de APTES. La deposición de APTES y poly(PFPA) en el sílice partículas son confirmadas por espectroscopia de fotoelectrones de rayos x (XPS), así como supervisadas por el cambio de tamaño de partícula medido por dispersión dinámica de la luz (DLS). (Amino-PEG) también se realiza para mejorar el hydrophilicity superficial de los granos, sustitución parcial de poly(PFPA) con poly(ethylene glycol) amine functionalized. La poly(PFPA) PEG-sustituido injertado silicona granos luego se inmovilizan con anticuerpos para el uso de IP. Para la demostración, se emplea un anticuerpo contra la proteína quinasa RNA-activado (PKR) y eficiencia IP se determina por borrar occidental. Los resultados del análisis muestran que los granos de anticuerpo inmovilizado de hecho pueden utilizarse para enriquecer PKR mientras que las interacciones entre proteínas no específicas son mínimas.
Introduction
Cepillos poliméricos reactivos han recibido mucho interés en los últimos años. Pueden ser utilizados para inmovilizar moléculas funcionales en materiales orgánicos o inorgánicos para crear superficies activadas con aplicaciones en áreas tales como detección y separación1,2,3,4, 5. Entre los polímeros reactivos registrados, los que contienen unidades de ester pentafluorophenyl son particularmente útiles debido a su alta reactividad con aminas y resistencia hacia la hidrólisis6. Un tal polímero es poly(PFPA), y puede ser fácilmente funcionalizada polimerización posterior con moléculas que contienen aminas primaria o secundaria7,8,9,10. Ejemplo, poly(PFPA) cepillos fueron reaccionados con amino-spiropyrans para crear superficies sensibles a la luz7.
La preparación de poly(PFPA) y sus aplicaciones se han descrito en un número de anteriores publicaciones6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. En particular, Theato y colaboradores informaron la síntesis de poly(PFPA) cepillos a través de “injerto a” tanto “injerto de” métodos7,8,10,11,12 . En el “injerto a” enfoque, un poli (methylsilsesquioxane)-polivinílico (acrilato del pentafluorophenyl) (polímero híbrido de poly(MSSQ-PFPA)) fue sintetizado8,10,11,12. El componente de poly(MSSQ) fue capaz de adherencia fuerte forma con un número de diferentes superficies orgánicas e inorgánicas, permitiendo así que el componente poly(PFPA) formar una capa de pincel sobre la superficie del material cubierta. En el “injerto de” enfoque de superficie inició además reversible y polimerización de fragmentación cadena transferencia (SI-balsa) se empleó para preparar poly(PFPA) cepillos7. En este caso, un agente de transferencia de cadena inmovilizada de la superficie (SI-CTA) primero fue unido covalentemente al sustrato por reacción sílice-silano. El inmovilizado SI-CTA participó entonces en la polimerización de la SI-balsa de monómeros de la PFPA, generando poly(PFPA) densamente cepillos con enlace covalente estable al sustrato.
Mediante la utilización de los cepillos de poly(PFPA) sintetizados mediante polimerización SI-balsa, hemos demostrado recientemente la inmovilización de anticuerpos en las partículas de sílice poly(PFPA) injertado y su posterior aplicación en la purificación de la proteína18. El uso de cepillos poly(PFPA) para inmovilización de anticuerpos fue encontrado para resolver una serie de problemas asociados con la actual separación de las proteínas a través de IP. Convencional IP se basa en el uso de la proteína A/G como un enlazador para anticuerpo inmovilización19,20,21. Dado que el uso de la proteína A/G permite a los anticuerpos que se unirán con una orientación específica, se logra eficiencia de recuperación de antígeno blanco alto. Sin embargo, el uso de la proteína A/G sufre de interacción de la proteína no específica, así como la pérdida de anticuerpos durante la recuperación de la proteína, los cuales contribuyen a un alto nivel de ruido de fondo. Para resolver estas deficiencias, reticulación directo de los anticuerpos a un soporte sólido ha sido explorado22,23,24. La eficacia de estas técnicas es generalmente baja debido a la orientación aleatoria de los anticuerpos de reticulado. Para el substrato poly(PFPA) injertado, la inmovilización de anticuerpos es permanente, mediante la reacción de intercambio entre las unidades de la PFP y funcionalidad de Amina en anticuerpos. Aunque la orientación de anticuerpo es todavía aleatoria, el sistema se beneficia de tener muchos sitios PFP reactivos, controlables por el grado de polimerización. Además, demostramos que por sustitución parcial de unidades de la PFP con amino-PEG, hydrophilicity superficial puede ajustarse, mejorar la eficiencia de recuperación de proteína del sistema18. En general, las partículas de sílice poly(PFPA) injertadas mostraron ser una alternativa eficaz a IP tradicional con razonable eficiencia como mucho limpiador de fondo.
En esta contribución, se presenta un método alternativo para preparar superficie injertada poly(PFPA) para inmovilización de anticuerpos y la aplicación de la propiedad intelectual. En un proceso de dos pasos simples, como se ilustra en la figura 1, una molécula de vinculador APTES se deposita primero sobre la superficie de sílice, a continuación, el polímero de poly(PFPA) se une covalentemente a la molécula del vinculador mediante la reacción entre las unidades de la PFP en la polímero y las funciones de la amina en APTES. Este método de preparación permite el entrecruzamiento permanente de poly(PFPA) a una superficie del sustrato, pero evita muchas complicaciones asociadas a CTA SI síntesis y polimerización de la SI-balsa de poly(PFPA) cepillos. Sustitución parcial de las unidades de la PFP con amino-PEG puede aún realizarse, permitiendo ajuste de las propiedades superficiales del cepillo de polímeros. Nos muestran los granos de sílice poly(PFPA) injertado así preparados pueden ser inmovilizados con anticuerpos y utilizados para el enriquecimiento de proteínas vía IP. El procedimiento de una preparación detallada del grano, inmovilización de anticuerpos y pruebas de IP se documentan en este artículo, para los lectores interesados en la búsqueda de una alternativa a la proteína convencional A/G basado en IP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La síntesis de poly(PFPA) injertado SiO2 cuentas se ilustra en la figura 1. Mediante el empleo de APTES como molécula de vinculador, cepillos de poly(PFPA) covalente injertados a SiO2 substrato pueden prepararse mediante un proceso de dos pasos simples. Aunque algunas de las unidades de la PFP son sacrificados por la reacción con APTES, se espera que un gran número de las unidades de la PFP permanecer disponible para la reacción posterior con amino-PEG o anticuerpo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Agencia para el desarrollo de defensa (Grant no. UD170039ID).
Materials
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
Riferimenti
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