Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток
Summary
Эта статья показывает мощный метод количественного определения митохондрий или лизосом в живых клетках. Сочетание конкретных Лизосома или митохондрии красители с дневно конъюгированных антител против поверхностных маркеров позволяет количественная оценка этих органеллы в смешанных клеточных популяций, как первичной клетки заготавливаемым от образцов тканей, с использованием многоцветная проточной цитометрии.
Abstract
Т-клетки используют различные обменные программы их функциональным потребностям во время дифференциации и пролиферации. Митохондрии являются важнейших клеточных компонентов, отвечающих за энергоснабжения клеток; Однако избыток митохондрии также производят реактивнооксигенных видов (ров), которые могут привести к смерти клетки. Таким образом количество митохондрий должны постоянно корректироваться в соответствии с потребностями клеток. Это динамическое регулирование достигается частично через функцию лизосомы, которые удаляют излишки/поврежденных органеллы и макромолекул. Следовательно сотовой митохондриальных и лизосомальных содержание являются основные показатели для оценки метаболической перестройки клеток. С развитием зонды для органеллы, хорошо изученных Лизосома или митохондрии конкретных красители стали доступны в различных форматах для обозначения сотовой лизосом и митохондрии. Многоцветная проточной цитометрии является общим инструментом для профиль клеток фенотипов и имеет возможность быть интегрированы с другими анализов. Здесь мы представляем подробный протокол о том, как совместить органеллы конкретных красители с поверхностных маркеров, окрашивание измерить количество лизосом и митохондрий в популяциях различных Т-клеток на проточный цитометр.
Introduction
Активация и пролиферацию клеток T являются важнейшие шаги для монтажа успешных иммунных реакций. Последние достижения показывают, что тесно связано с развитием и функции клеток T клеточный метаболизм. К примеру наивно T клетки полагаются в основном на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для удовлетворения спроса на энергию во время рециркуляции среди средних лимфоидных органов. После активации наивно T клетки претерпевают радикальные метаболических перепрограммирования, включая индукцию аэробного гликолиза для увеличения производства АТФ и выполнить огромную метаболические требования во время дифференцировки клеток и распространения. Клетки, которые не в состоянии следовать через метаболические потребности умирают апоптоза на1,2. В ходе метаболических перепрограммирование, митохондрии играют важную роль, поскольку они являются органеллы, значительной степени ответственность за производство АТФ для поставлять энергию для ячейки, и содержание сотовой митохондрий колеблется в ходе метаболических переключатели на протяжении Т-клеток развития и активации3. Однако накоплением лишних или повреждения митохондрий могут производить избыток рос, что повреждения липидов, белков и ДНК и в конечном итоге может привести к смерти4 ячейки
Чрезмерное или повреждения митохондрий, результатом метаболические изменения удаляются специализированной формой autophagy5, известный как mitophagy. Митохондрии окружены autophagosomes и затем сливается с лизосомы для деградации. Закрыть эти связи между митохондрии и лизосом вызвали большой интерес в6,7. К примеру, оксидативный стресс стимулирует митохондрии составить производными митохондрий везикулы (MDVs), которые предназначены для лизосомы деградации в фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN)-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) и Паркин (E3 убиквитин лигаза) 8зависимым образом. Было также установлено, что mitophagy имеет важное значение для перехода бежево белый Адипоцит9,10. Что еще более важно лизосомы являются не просто деградации отсек, но и регулятор клеточных сигналов. Накопление чрезмерного субстрат из-за недостатков фермента приводит к лизосомальных дисфункции, нарушая лизосомальных мембран проницаемости и влияет на Ca2 + гомеостаза11. Т-клеток функциональных дефектов в лизосомальных кислоты липаза (Лал)12 или лизосомальных метаболит транспортер нокаут мыши модель13 далее показали важность лизосом в поддержании гомеостаза Т-клеток. Митохондрии и лизосом являются неотъемлемой частью клеточной регуляции метаболизма. Таким образом измерение содержания клеточных митохондриальной был решающую показателем для оценки состояния обмена веществ и функциональных Т-клеток.
Анализы, обычно используется для количественного определения сотовой митохондриальной или лизосомальных содержимое включают immunoblot, электронная микроскопия, immunofluorescent окрашивание (КРП) и ПЦР-анализа митохондриальной ДНК копировать номера14,15, 16. Эти анализы, хотя immunoblot можно количественно сравнить уровни белка через различных образцов и электрон или если микроскопии можно визуализировать морфологические признаки эти органеллы17, несут определенные технические недостатки. Например это много времени приобрести достаточное количество клеток изображений с высоким увеличением и резолюции или сравнить уровни выражения протеина через десятки образцов, что делает эти анализы, считается низкой пропускной способности методы. Кроме того эти анализы может применяться только населению однородных клеток, таких как клеточных линий, но не для образцов тканей, которые состоят из смешанного населения.
Это также трудно применять эти анализы редких населения, для которых требование о минимальной ячейки чисел от 106 -108 невозможно соблюсти. Наконец клетки обычно лизированы или фиксированной во время процесса, что делает их несовместимыми с другими методами для получения дальнейшей информации. По сравнению с традиционными методами, на основе люминесцентных проточной цитометрии имеет относительно высокую пропускную способность – информация из всех клеток в образце состоит из смешанных клеточных популяций могут быть проанализированы и собранные одновременно. Кроме того можно обнаружить более 10 параметров на той же клетке и Сортировка ячеек, основанных на желаемый фенотипы для дальнейших анализов. Реактивная флуоресцентных зондов были использованы для обозначения лизосом и митохондрий в живых клеток и может быть обнаружен поток цитометрии18,19. Эти зонды органеллы конкретных клеток проницаемых и физико химические характеристики, которые позволяют им быть сосредоточены в определенных местах субцеллюлярные или органеллы. Удобно эти датчики доступны в различных форматах флуоресцентные, таким образом позволяя их применение для многоцветного анализа.
Этот протокол описывает подробно как совместить поверхности маркер, окрашивание красками Лизосома или митохондрии специфичные для метки лизосомы или митохондрий в живой клетки. Это особенно полезно для образцов, созданных из основной ткани и органы, которые часто состоят из гетерогенных клеточных популяций. Исследователи могут определить клеточных популяций интерес выражением их поверхности маркер и конкретно измерить лизосомальных или митохондриальной содержимое через органеллы конкретных красителей в этих клетках. Здесь мы демонстрируем подробную процедуру анализа гранулярных потока, который оценивает лизосомальных или митохондриальной массы в основных селезеночной Т-клеточной субпопуляций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол сочетает в себе органеллы специфичные красителей и поверхности маркер окрашивания для количественного определения количество митохондрий или лизосом в популяциях различных Т-клеток. Этот метод был разработан для преодоления ограничения ячейки номер и однородности тре…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
В разработке этого протокола был поддержан грантов из Тайваня министерства науки и технологии (большинство) NSC103-2320-B-010-002-MY2 и MOST104-2628-B-010-002-MY4 C.L. Hsu. К.В Вэй является получателем отличные тезис награду от Института микробиологии и иммунологии, национального университета Ян-мин.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
Riferimenti
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
