Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.
Abstract
Unser Immunsystem besteht aus einer Zahl und Vielfalt der immunen Zellen einschließlich der regulatorische T-Zellen (Treg)-Zellen. Treg-Zellen können in zwei Untergruppen, Zebrafischembryonen abgeleiteten Treg (tTreg) und peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen unterteilt werden. Sie befinden sich in verschiedenen Organen unseres Körpers und durch spezifische Marker, wie Helios und Neuropilin 1 unterschieden werden können. Es wurde berichtet, dass tTreg Zellen funktionell mehr suppressive als pTreg Zellen sind. Daher ist es wichtig, den Anteil der tTreg und pTreg Zellen zu bestimmen, bei der Untersuchung von heterogenen Zellpopulationen. Hier sammelten wir Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten und Milz von Normoglycemic nicht adipösen diabetischen Mäusen tTreg Zellen aus pTreg Zellen mittels Durchflusszytometrie zu unterscheiden. Wir vorbereitet manuell einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen. Fluorochrom konjugiert Oberfläche CD4, CD8, CD25 und Neuropilin-1 Antikörper wurden verwendet, um die Zellen zu beflecken. Sie waren über Nacht im Kühlschrank aufbewahren. Am nächsten Tag waren die Zellen mit intrazellulären Foxp3 und Helios Antikörper konjugiert Fluorochrom befleckt. Diese Markierungen wurden verwendet, um die zwei Teilmengen von Treg-Zellen zu kennzeichnen. Dieses Protokoll zeigt eine einfache aber praktische Möglichkeit, einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz vorbereiten und verwenden Sie sie für spätere durchflusszytometrischen Analyse.
Introduction
Regulatorische (Treg) T-Zellen sind entscheidend für die Homöostase des Immunsystems. Treg-Zellen werden durch die Expression von Oberflächenantigenen CD4 und CD25 und die Transkription Faktor Forkhead Box P3 (Foxp3)1,2,3definiert. Sakaguchi Et Al. zeigten erstmals, dass CD25 auf T-Suppressor-Zellen in Mäusen4konstitutiv exprimiert wird, die eine bahnbrechende Beobachtung für die Identifizierung des menschlichen Treg-Zellen zur Verfügung gestellt. Treg-Zellen spielen eine zentrale Rolle im Immuntoleranz durch gleichzeitiges eine unterdrückende Fähigkeit über eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich Zytolyse durch die Sekretion von Granzymen induzieren Apoptose, Zytokin-Verbrauch und Hemmung durch den Ausdruck von zytotoxischen T-Lymphozyten Antigen 45. Darüber hinaus können sie hemmende Zytokine wie z. B. die Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β), Interleukin-10 (IL-10) und IL-355absondern. Treg Zellen natürlich abgeleitet werden aus dem Thymus, in diesem Fall sind sie Zebrafischembryonen abgeleitete Treg (tTreg) Zellen bezeichnet, oder in diesem Fall nennt man peripher induzierte Treg (pTreg) Zellen in den peripheren Organen induziert werden.
Helios, ein Mitglied der Adelsfamilie Ikaros Transkription Faktor wurde berichtet, dass ein Marker für die Unterscheidung zwischen tTreg Zellen und pTreg Zellen6. Zwei andere Gruppen berichtete später, dass Neuropilin 1 (Nrp1), ein semaphorin-III-Rezeptor als Oberfläche Marker für tTreg Zellen unter bestimmten Bedingungen7,8dienen könnte. Dennoch haben Singh Et Al. gezeigt, dass Helios eine bessere Markierung in diesem Zusammenhang in naive Mäuse9.
Die Teilmengen von Treg-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Immunsystems und den Schutz gegen Autoimmunität und Infektionen. Daher ist es wichtig, die Zahlen und Proportionen dieser Populationen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Gewebe zu bestimmen. Um dies zu erreichen, muss man sich einzelne Zellsuspensionen von diesen Organen vorzubereiten. Eine Reihe von Protokollen wurden beschrieben oder in früheren Studien verwendet. Vor allem, wurden automatische Dissociators in zuvor veröffentlichten Berichte10,11verwendet. Mit automatischen Dissociators ist bequem und zeitsparend, aber es ist ein teures Verfahren. Daher haben wir eine manuelle Methode verwendet, um einzelne Zellsuspensionen von murinen Zebrafischembryonen Drüsen, Pankreas Lymphknoten (PDLNs) und Milz von Normoglycemic nicht adipösen Diabetiker (NOD) Mäuse und isolierte Einzelzellen aus diesen Organen vorzubereiten. Mit dieser Methode in unserer früheren Studien und wir fanden, dass die manuelle Methode für die Zubereitung von einzelnen Zellsuspension so effizient wie automatische Dissociator Methode9,12,13,14. Darüber hinaus wir Durchflusszytometrie verwendet, um die Proportionen der CD4 bestimmen+CD8–CD25+Foxp3+ Treg Zellen und die Teilmengen von Treg-Zellen tTreg und pTreg Zellen. Die tTreg und pTreg Zellen wurden ausgezeichnet mit Helios und Nrp1 als Marker für tTreg Zelle. So zeigen unsere Ergebnisse, dass die manuelle Methode für die Vorbereitung der einzelnen Zellen effizient funktioniert und vorbereitete Einzelzelle Suspensionen können weiter verwendet werden, für Studien mit Durchflusszytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wir isolierte Einzelzellen aus Zebrafischembryonen Drüsen, PDLNs und Milz von Mäusen, NICKEN, und untersucht den Ausdruck von Helios und Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg Zellen mittels Durchflusszytometrie. In der vorliegenden Studie wurden NOD Mäuse verwendet, das heißt ein Mausmodell des Typ 1 Diabetes. In einer früheren Studie haben wir die Wildtyp-Maus-Stämmen CD-1 und C57BL/6 Mäusen verwendet, um zu untersuchen, ob Helios oder Nrp1 eine bessere Ma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die vorliegende Studie wurde von der schwedischen Forschungsrat, EXODIAB, der schwedischen Diabetes Foundation, schwedische Kind Diabetes Fonds, SEB Diabetesfonden und O.E Och Edla Johanssons Vetenskapliga Stiftelse finanziell unterstützt. Autoren möchten Dank pro-Ola Carlsson und Stellan Sandler für ihre Unterstützung und Diskussionen.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
Riferimenti
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