Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정
Summary
여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.
Abstract
규제 T 세포 (Treg) 세포 등 면역 세포의 다양 한 숫자와 우리의 면역 체계에 의하여 이루어져 있다. Treg 세포는 두 개의 하위 집합, thymic 파생된 Treg (tTreg) 세포와 주변 유도 Treg (pTreg) 셀으로 나눌 수 있습니다. 그들은 우리의 신체의 다른 장기에 존재 하 고 헬 리오스 Neuropilin 1 등 특정 마커에 의해 구별 될 수 있다. TTreg 세포는 pTreg 셀 보다 기능적으로 더 진압으로 보고 되었습니다. 따라서, 그것은 다른 유형의 세포 인구를 조사할 때 tTreg와 pTreg 세포의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 수집 thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프절과 spleens cytometry를 사용 하 여 pTreg 세포에서 tTreg 셀을 구별 normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 쥐에서. 우리는 수동으로 단일 셀 정지가이 기관에서 준비. 형광 색소 활용 된 표면 CD4, CD8, CD25, 그리고 Neuropilin 1 항 체는 세포 얼룩 사용 되었다. 그들은 하룻밤 냉장고에 보관 했다. 다음 날, 세포 형광 색소 활용 된 세포내 Foxp3와 헬 리오스 항 체와 얼룩이 있었다. 이러한 마커는 Treg 세포의 두 하위 집합 하 사용 되었다. 이 프로토콜에서는 murine thymus, 림프절, 비장을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하 고 이후의 흐름 cytometric 분석을 위해 그들을 사용 하는 간단 하지만 실용적인 방법을 보여 줍니다.
Introduction
규정 (Treg) T 세포는 면역 시스템의 항상 성에 대 한 중요 합니다. Treg 세포 표면 항 원 c d 4의 식와 CD25, 및 녹음 방송 요인 forkhead 상자 P3 (Foxp3)1,2,3에 의해 정의 됩니다. 사 카 구치 외. 먼저 CD25 constitutively 쥐4, 인간 Treg 세포의 식별에 대 한 선구적인 관찰을 제공 하는 T 억제기 세포에 표현 된 보여주었다. Treg 세포 apoptosis, cytokine 소비 및 세포 독성의 표현을 통해 억제를 유도 하는 granzymes의 분 비를 통해 cytolysis를 포함 하 여 메커니즘의 다양 한 통해 진압 능력을 발휘 하 여 면역 관용에 중심 역할을 담당 T-림프 구 항 45. 또한, 그들은 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 인터 루 킨-10 (IL-10) 및 IL-355등 억제 cytokines를 분 비 수 있습니다. Treg 세포 자연스럽 게 파생 될 수 있다, thymus에서 thymic 파생된 Treg (tTreg) 셀, 지정 되어 어떤 경우에 또는 케이스 주변 유도 Treg (pTreg) 셀 이라고 그 주변 기관에서 유도 될 수 있다.
헬 리오스, Ikaros 녹음 방송 요인 가족의 일원이 tTreg 세포 사이 구별을 위한 마커 이기 위하여 보고 되었다 그리고 pTreg 세포6. 나중에, 다른 두 그룹 Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III 수용 체 특정 조건7,8에서 tTreg 세포에 대 한 표면 표식으로 될 수 있는 보고. 그럼에도 불구 하 고, 싱 외. 헬 리오스는 순진한 마우스9에서 이런이 맥락에서 더 나은 표식으로 나타났습니다.
Treg 세포의 하위 집합 및 면역 및 감염에 대 한 보호 면역 체계의 항상성 유지에 중추적인 역할. 따라서, 그것은 숫자와 림프 및 비 림프 조직에 이러한 인구의 비율을 결정 하는 것이 중요입니다. 이를 위해, 하나의 단일 셀이이 기관에서 정지를 준비 하고있다. 여러 프로토콜 설명 또는 이전 연구에서 사용 된 있다. 주로, 자동 dissociators 이전 게시 된 보고서10,11에 사용 되었습니다. 자동 dissociators를 사용 하는 편리 하 고 시간 절약, 하지만 그것은 비싼 절차. 따라서, normoglycemic 비 뚱뚱한 당뇨병 (끄 덕) 쥐, 및이 기관에서 격리 된 단일 셀에서 murine thymic 땀 샘, 췌 장 배출 림프 노드 (PDLNs) 및 spleens 단일 셀 정지를 준비 하는 수동 방법을 사용 했습니다. 이 방법은 우리의 이전 연구에서 사용 되었습니다 그리고 우리는 단일 세포 현 탁 액을 준비 하기 위한 수동 방법 자동 dissociator 방법9,12,,1314만큼 효율적 이다 발견. 또한, 우리는 CD4의 비율을 확인 하려면 cytometry 사용+CD8–CD25+Foxp3+ Treg 세포와 Treg 하위 집합 tTreg 및 pTreg 세포 세포. TTreg 및 pTreg 세포 tTreg 세포에 대 한 표식으로 헬 리오스와 Nrp1를 사용 하 여 구분 했다. 따라서, 우리의 결과 단일 셀을 준비 하기 위한 수동 방법 효율적으로 작동 하 고 준비 된 단일 셀 정지 추가 연구 cytometry 사용 하 여 사용 될 수 있습니다 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서 우리는 thymic 동맥, PDLNs 및 끄 덕 임 쥐의 spleens에서 단일 셀을 절연 하 고 헬 리오스와 CD4에 Nrp1의 식을 조사+CD8–CD25+Foxp3+ Treg 세포 cytometry 사용 하 여. 현재 연구는 타입-1 당뇨병의 murine 모델은 끄 덕 임 쥐가 사용 되었다. 이전 연구에서 우리는 헬 리오스 또는 Nrp1 tTreg pTreg 세포에서 세포를 구별을 위한 더 나은 표식 인지를 조사 하는 야생 타입 마우스 C…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현재 연구는 스웨덴 연구 위원회, EXODIAB, 스웨덴 당뇨병 재단, 스웨덴 어린이 당뇨병 펀드, 셉 Diabetesfonden 및 O.E. 그리고 Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse에 의해 재정적으로 지원 되었다. 저자 또한 감사 당-올라요 Carlsson Stellan 샌들러 그들의 지원 및 토론에 대 한 같은 것 이다.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
Riferimenti
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