Fastsettelse av regulatoriske T-celle delsett i Murine Thymus, bukspyttkjertelen drenering lymfeknute og milt bruker flowcytometri
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å forberede enkeltceller fra murine thymus, bukspyttkjertelen drenering lymfeknute og milt å ytterligere studere disse celler ved hjelp av flowcytometri. I tillegg ble denne protokollen brukt for å bestemme delsett av regulatoriske T celler ved hjelp av flowcytometri.
Abstract
Våre immunsystem består av et tall og et utvalg av immunceller inkludert regulatoriske T celler (Treg) celler. Treg celler kan deles inn i to undergrupper, thymic avledede Treg (tTreg) cellene og perifert indusert Treg (pTreg). De finnes i forskjellige organer i kroppen og kan være preget av bestemte markører, som Helios og Neuropilin 1. Det har blitt rapportert at tTreg celler er funksjonelt mer undertrykkende enn pTreg celler. Derfor er det viktig å bestemme andelen av både tTreg og pTreg celler når undersøker ulike celle populasjoner. Her har vi samlet thymic kjertler, bukspyttkjertelen drenering lymfeknuter og spleens fra normoglycemic ikke-obese diabetiker mus å skille tTreg celler fra pTreg celler ved hjelp av flowcytometri. Vi forberedt manuelt enkeltcelle suspensjoner fra disse organene. Fluorochrome bøyd overflate CD4, CD8, CD25 og Neuropilin 1 antistoffer ble brukt stain cellene. De ble holdt i kjøleskapet over natten. På den neste dagen, var cellene farget med fluorochrome konjugert intracellulær Foxp3 og Helios antistoffer. Disse markørene ble brukt for å karakterisere de to undergrupper av Treg celler. Denne protokollen demonstrerer en enkel, men praktisk måte å forberede enkeltceller fra murine thymus, bukspyttkjertelen drenering lymfeknute og milt og bruke dem for påfølgende flyt cytometric analyse.
Introduction
Regulatoriske T (Treg) celler er avgjørende for homeostase av immunsystemet. Treg celler er definert av uttrykk for overflate antigener CD4 og CD25, og den transkripsjon faktor forkhead boksen P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. først viste at CD25 er constitutively uttrykt i T suppressor cellene i mus4, som ga en banebrytende observasjon for identifikasjon av Treg menneskeceller. Treg cellene spille en sentral rolle i immunforsvaret toleranse ved en undertrykkende evne via en rekke mekanismer, inkludert cytolysis gjennom utskillelsen av granzymes å indusere apoptose, cytokin forbruk og hemming gjennom uttrykk for cytotoksiske T-lymfocytt antigen 45. I tillegg kan de skiller hemmende cytokiner som transformerer vekstfaktor beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) og IL-355. Treg celler kan naturlig utledes fra thymus, da de angis thymic avledede Treg (tTreg) celler, eller de kan bli indusert i eksterne organer i dette tilfellet kalles perifert indusert Treg (pTreg) celler.
Helios, medlem av Ikaros transkripsjon faktor familien, ble rapportert å være en markør for å skille mellom tTreg celler og pTreg celler6. Senere, rapportert to andre grupper at Neuropilin 1 (Nrp1), en semaphorin III-reseptor, kunne tjene som en overflate markør for tTreg celler under visse forhold7,8. Likevel, Singh et al. har vist at Helios er en bedre i denne sammenheng i naiv mus9.
Delsett av Treg cellene spille en sentral rolle i vedlikehold av homeostase av immunsystemet og i beskyttelse mot autoimmunitet og infeksjon. Derfor er det viktig å bestemme tallene og proporsjoner av disse befolkningene i både lymfoide og ikke-lymfoid vev. For å oppnå dette, må man forberede enkeltcelle suspensjoner fra disse organene. Flere protokoller er beskrevet eller brukes i tidligere studier. Hovedsakelig, har automatisk dissociators blitt brukt i tidligere publiserte rapporter10,11. Bruke automatiske dissociators er praktisk og tidsbesparende, men det er en kostbar prosedyre. Derfor har vi brukt en manuell metode for å forberede enkeltcelle suspensjoner fra murine thymic kjertler, bukspyttkjertelen drenering lymfeknuter (PDLNs) og spleens fra normoglycemic ikke-obese diabetiker (NIKKER) mus og isolert enkeltceller fra disse organene. Denne metoden er brukt i våre tidligere studier, og vi fant at den manuelle metoden for å forberede enkeltcelle suspensjon er så effektiv som automatisk dissociator metode9,12,13,14. Videre har vi brukt flowcytometri for å bestemme CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg celler og delsett av Treg celler tTreg og pTreg celler. TTreg og pTreg cellene var preget av Helios og Nrp1 indikatorer for tTreg celle. Dermed indikerer våre resultater at den manuelle metoden for å forberede enkeltceller fungerer effektivt og forberedt enkeltcelle karantener kan brukes videre til studier med flowcytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien vi isolert enkeltceller fra thymic kjertler, PDLNs og spleens av NIKK mus, og undersøkt uttrykk for Helios og Nrp1 i CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg celler ved hjelp av flowcytometri. Studien, ble NOD mus brukt, som er en murine modell av type 1 diabetes. I en tidligere studie, har vi brukt vill type musen stammer CD-1 og C57BL/6 mus for å undersøke om Helios eller Nrp1 er en bedre indikator for å skille tTreg celler fra pTreg celler. I denne studien brukt vi en li…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet økonomisk av svenske Forskningsrådet, EXODIAB, den svenske Diabetes Foundation, svenske barn Diabetes fondet, se Diabetesfonden og O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Forfatterne vil også takk Per-Ola Carlsson og Stellan Sandler for deres støtte og diskusjoner.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
Riferimenti
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
