이 문서는 니코틴 uncaging에 의해 마우스 뇌 조각에서 nicotinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (nAChRs) 공부에 대 한 메서드를 제공 합니다. 동시 패치 클램프 기록 및 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법으로 사용할 경우 해 신경 생물학의 깊은 이해를 제공 하는 세포 형태학 nicotinic 수용 체 기능을 연결 니코틴 uncaging 합니다.
아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 신경 프로세스의 다양 한 변조를 통해 작동 하지만이 함수를 실시 하는 세포 내 subcellular 위치 ACh 수용 체 기능을 연결할 도전 되었습니다. Nicotinic ACh 수용 체 (nAChRs) 네이티브 뇌 조직에서의 subcellular 위치, 공부 하는 광학 방법 electrophysiological 녹음 하는 동안 개별 위치 신경 막 근처에서 니코틴의 정확한 출시 위해 개발 되었습니다. 패치 클램프 뉴런 뇌 조각으로 가득 차 있습니다 염색 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 동안 그들의 형태학을 시각화 하 고 하나 이상의 세포 막 근처 405 nm 레이저 빔을 초점 빛 플래시 실행 됩니다 니코틴 uncaging. 세포질 현재 심한, 측정 그리고 기록 된 신경의 고해상도 3 차원 (3D) 이미지 nAChR 반응과 세포 형태학의 화해 수 있도록 이루어집니다. 이 메서드는 복잡 한 조직 준비, cholinergic neurotransmission의 이해를 강화 하는 약속에 nAChR 기능 배포의 상세한 분석에 대 한 수 있습니다.
해 신호 attentional 제어, 지 운동, 및 보상1,2를 포함 하 여 수많은 두뇌 프로세스를 조절 한다. 아 세 틸 콜린 (ACh) 전송 향상 약물 인지3해 시스템에 대 한 중요 한 역할을 암시 하는 Alzheimer의 질병과 관련 된 인지 장애를 치료 하는 데 사용 됩니다. 해 수용 체와 건강 및 질병 상태에서 회로의 향상 된 이해는 여러 가지 신경 질병/장애에 대 한 더 나은 치료 접근으로 이어질 수 있습니다.
Nicotinic ACh 수용 체 (nAChRs) 양이온 또는 응답으로 생 ACh exogenous 니코틴 담배 제품에서 유출 하는 ligand 문을 단 이온 채널의 가족입니다. 설명4첫 신경 전달 물질 수용 체 가운데 그들이 사실을 감안할 때, nAChR 약리학 및 위치 근육 섬유에 근육 형 수용 체에 대 한 파악 이다. 대조적으로, 비교적 작은 약리학 및 두뇌에서 네이티브 nAChRs의 subcellular 배포에 대 한 알려져 있다. 지식에이 격차는 최근 세포 이미징 및 electrophysiological 기록5중 뇌 조직에서 nAChRs의 공간적으로 제한 하 고 급속 한 활성화에 대 한 있도록 새로운 화학 프로브를 개발 하 여 해결 됩니다. 여기,이 접근에 관련 된 주요 방법론 단계 설명, 신경 구조와 nAChR 함수를 연결 하는 기능 향상의 전반적인 목표와 함께 합니다.
Photoactivatable 니코틴 (PA-Nic; 화학 이름: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-아미노] coumarin-4-yl] 메 틸 니코틴) photolyzed ~ 405 nm 레이저 섬광 효율적으로 니코틴5,6출시 될 수 있습니다. Uncaging, 이전 펜 실바 니 아-Nic 솔루션에서 안정적 이며 전시 아니 형편이 약리학 또는 광화학 기능5. Photolysis, 후 출시 된 니코틴은 예상 대로 nAChRs 활성화 되며 uncaging 부산물 약리학 불활성5. 연속파 레이저는 출력 전력 photolysis 광원으로 사용 > 1 mW 샘플에서 측정. 지역화, 타겟된 사진-자극은 및 결합 된 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM), 세포 막으로 찾을 수 있는이 방법의 두 가지 주요 장점을 완벽 하 게 실현: photolysis 속도 공간 정밀도.
대부분의 측면에서 PA Nic의 photolysis 뇌 조각 내 수용 체에 ligands nAChR 제공의 다른 방법에 우량 하다. 이러한 접근 등 목욕 응용 프로그램7 지역 마약 배달 통해 호흡기 피 펫8입니다. 전 접근-적용된 약물의 장기 효과 강조 하는 경향이, 반면 후자의 접근 시련과 셀에 걸쳐 응답 속도에 변화에서 겪을 수 있다. 이 다른 접근의 둘 다 적절 하 게 동일한 신경 세포에서 다른 세포 위치에 수용 체 활동을 구분할 수 있습니다. 하지만 ACh의 릴리스 Optogenetically 활성화 네이티브 nAChRs9,,1011의 조사를 위해 사용 되는 매핑 subcellular nAChR 위치에 대 한 유용한 입증 되지 않은. 게다가,이 접근을 이용 하 여 대부분 연구 비정상적인 해 전송12,,1314, 와 ChR2을 표현 세균성 인공적인 염색체 유전자 변형 마우스에 의존 해야 15 , 16 , 17.
PA Nic photolysis 해 수용 체를 공부만 광학 접근 아니다. 갇힌된 carbachol 기능 배양된 세포18 과 뇌 조각19, ACh 수용 체 활동을 매핑하는 데 사용 했다 하지만 PA 상태가의 개발 하는 동안 비교 연구를 위해 상용 되었다 루 테 늄 bis (bipyridine)-복잡 한 니코틴 (RuBi-니코틴) 니코틴 uncaging20에 대 한 허용 것으로 알려졌다 하지만 RuBi-니코틴 머리 비교에서 PA Nic에 열 등 한 입증의 상업적인 준비 연구5. 비-상업와 같은 비교 실험을 반복 하는 것이 유용할 수 있습니다 높은 RuBi 니코틴을 정화 하는 그것의 보이는 흡수 해 연구에 대 한 PA-Nic의 기능을 칭찬 수로. 마지막으로, nAChRs가 또한 되었습니다 광학 조작 사진 전환 ligands의 수용 체 유전자 변형21조합을 사용 하 여. 이 방식은 수정된 nAChR 장점 및 단점으로 볼의 대상으로 유전자의 기능/요구 사항으로 뇌 조직에 PA-Nic photolysis를 보완 합니다.
이 방법의 몇 가지 주요 요구 사항은 주목 해야 한다. 첫째, 적절 한 시각화 방법 신경 막 정확 하 게 찾이 필요 합니다. 배양된 세포, 공부를 할 때 기존의 피-형광 현미경 검사 법으로 이미징 충분 한 될 수 있지만 뇌 조각 또는 다른 두꺼운 조직 준비에 뉴런에서 녹음, 2PLSM 또는 confocal 현미경 검사 법은 요구 사항. 둘째, 적당 한 방법 photolysis 레이저 빔 위치 필요 합니다. 이 방법은 래스터 이미징 빔 및 포인트 photoactivation uncaging 레이저 빔22,,2324를 사용 하 여 검색을 위한 두 개의 독립적인 x-y 거울으로 듀얼 검 류 계 스캔 헤드를 활용 합니다. 다른, 더 많은 제한 된 솔루션 또는 래스터 스캔 이미징 빔 및 uncaging 광속, 또는 (2) 간단 하 게 되도록 셀 가져 시야의 센터에 uncaging 빔을 감독 (1) 단일-검 류 계 스캔 머리와 같은 가능 하다 플래시 photolysis을 위한이 위치. 셋째, 시스템은 필요 하나 실험 동안 생리 신호를 수집 하고자 하는 경우 동시 electrophysiological 기록. 위의 요구 사항 적합 한 모든 광학 이미징 기술, 최근 설명된5로 만나게 될 수 있습니다. 다음, 상세한 프로토콜은 포함 하는이 방법의 주요 단계를 설명 합니다.
PA Nic 응용 프로그램/전달 방법의 선택이 지역화 된 사진-자극 기법에서 가장 중요 한 단계입니다. 두 가지 방법, 목욕 응용 프로그램 및 로컬 관류, 각 고유한 장점과 한계를 제공 합니다. 선택은 셀 유형의 관심 nAChR 기능 식 수준에 의해 크게 영향을. 그것은 종종 목욕 응용 프로그램 데이터 해석을 용이 하 게 기록 된 셀을 둘러싼 유니폼 프로브 농도 대 한 허용 기능 식 수준 높은 때 목욕 응용 프로그램을 사용 하는 것이 좋습니다. 목욕 응용 프로그램 또한 전체 과정을 쉽게 조직에 두 번째 관류 피 펫에 대 한 필요성을 제거 합니다. 그러나, 비싼 목욕 응용 실험 당 더 많은 비용이 화합물.
일반적으로, 문제 해결 이해 왜 아무 nAChR 활성화 본된 다음 플래시 photolysis 하려고 포함 됩니다. PA Nic와 이전 공부 하지는 셀 형식으로 작업할 때 탐정 ACh의 로컬 퍼프-응용 프로그램을 수행 해야 또는 여부를 충분 한 수용 체는 기능적으로 결정 하는 니코틴 표현5. 시스템 photolysis 응답을 감지 할 수 확인 하려면 제어 실험 중간 habenula 신경 수용 체30의 표현에서 행해져야 한다. 이 두뇌 지역에서 PA Nic 목욕 응용 프로그램은 가능, 유효성 검사 실험 하는 것이 좋습니다. 이러한 유효성 검사 실험을 수행한 후만 하나 이동 한다 unstudied 셀 형식. PA-Nic의 농도 증가, 플래시 강도 또는 펄스 기간 증가를 보증 수 있습니다 실험적인 시스템을 검증 하는 경우 응답 남아 매우 작은 또는 탐지 nAChR 긍정적인 allosteric 변조기 nAChR 향상을 추가합니다 활동6또는 이들의 어떤 조합.
때때로, uncaging은 너무 커서, 간접 전압의 결과로 상당한 nAChR 활성화 문이 나+ 채널 활성화와 가난한 공간 클램프 인해 클램프되지 내부 전류. 이러한 아티팩트는 완전히 무명 nAChR 안쪽으로 전류와 데이터 해석 불가능 하 게, 기록 피 펫에 QX-314 (2 mM)의 포함에 의해 제거할 수 있습니다. 그들은 또한 PA-Nic의 농도 감소 시켜 또는 플래시 강도 또는 펄스 기간을 줄여 제거 될 수 있습니다. 모든 보이는 빛 사진 자극 실험에서 자극을 피하기 위해 의도 하지 않은 자극/photolysis 위 또는 원하는 초점 비행기 아래 사이트를 선택할 때 배려를 행사 해야 합니다. 또한 고 때 해당 레이저 전원 해야 합니다 항상 수 적정 생리 적인 응답을 재현 하. 그것은 특히 z 축 photostimulation의 위/아래 초점 자리 활성화는 ligands 수 있습니다 여전히 확산 하 고 연구는 생물 학적 시스템 (예:, 수용 체)와 상호 작용으로 갇힌된 ligands, 작업할 때 알고 있어야 하는 것이 중요.
PA Nic 레이저 플래시 photolysis 수 없습니다 모든 수사에 대 한 적절 한 몇 가지 제한이 존재. 첫 번째는 적절 한 설정의 상대적으로 높은 비용입니다. 그대로 뇌 조각으로 작업할 때 dendrites 필요 2 광자 현미경 같은 정교한 시각화 시스템 처럼 작은 직경 구조 근처 uncaging. Ti:sapphire, 공연 2 광자 현미경에 대 한 가변 적외선 펄스 레이저의 높은 비용 이외는 듀얼 검 류 계 시스템 독립적으로 위치 하지 두 개의 레이저 광선 더 시스템 비용을 증가 시킵니다. 조사는 충분 한 전문성과 시간을 구성, 문제 해결, 이러한 시스템을 유지 하는 경우 집에서 만든 시스템을 사용 하 여 전체 시스템 비용을 줄일 수 있습니다. 종종 두 번째 제한 포함 낮은 nAChR 기능 식, 부분적으로 위에서 언급 한 단계를 취 함으로써 완화 될 수 있습니다, 하지만이 성공 하지 못할 수 있습니다. 일반적으로, 하나 agonists의 퍼프-응용 프로그램을 다음 ligand 활성화 전류를 측정할 수 없다, 만약 PA Nic 플래시 photolysis 전압 클램프 아래 하지 허용 결과 얻을 수 있습니다. 세 번째 제한 포함 본질적인 형광 PA 상태가 PA-Nic의 ~ 405 nm 빛을 흡수 하 고 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 알 렉 사 4885비슷한 범위에서 방출. PA Nic 농도 ~ 1 mM를 초과 하는 경우이 형광 속성 동시에 신경 구조를 시각화 도전 할 수 있습니다. 이 줄이기 위해 쉽게 관류 피 펫에서 PA-Nic의 흐름을 제어할 수 중요 하다. 정기적으로, PA Nic 흐름 멀리 확산 형광 분자를 허용 하도록 중단 됐다. 이 다시 uncaging 광속의 자리 위치를 확인 하기 위한 신경의 이미징 허용. 4 잠재적인 제한 언급 하는 photolysis에 대 한 405 nm 빛의 사용을 포함. 405와 같은 짧은 파장 nm 두뇌 분할 같은 복잡 한 조직에 더 산란 하는 경향이 있다. 따라서, 주어진된 플래시 강도 및 기간에 uncaging 응답 진폭 및 감퇴 속도 론 수 수 차동 영향을 조각 내 uncaging 초점의 깊이. NAChRs의 생물 학적 측면에 대 한 결론으로이 중요 한 경고를 해야한다.
이 지역화 된 레이저 플래시 photolysis 기술은 최근 nAChR 신경 생물학에 대 한 새로운 정보를 밝히기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어 만성 니코틴 노출 perisomatic 및 중간 habenula 뉴런5수지상 nAChR 기능을 향상 시킵니다. 그것은 또한 복 부 tegmental 지역 조미료 신경 그들의 perisomatic에 수지상 세포 구획6기능 nAChRs 익스프레스 처음으로 보여줄 수 있도록 사용 되었다. 이 기술을 사용 하는 많은 잠재적인 미래 그리고 접근에는 있는 대뇌 피 질의 각 추 모양 신경31 등 대뇌 피 질32, 수 표현 nAChRs가33 다른 주요 신경 종류에 적용할 수 있습니다. , 그리고 해 마19. 이 기술은 또한34 다른 신경 구획을 특정 수용 체 하위 지역화를 편집 하는 약리학 또는 nAChR 유전자와 결합 수 있었다. 접근 포함 하 되이 제한 되지 않고, 그 PA Nic5와 병렬로 개발 다른 coumarin 갇힌 화합물에 쉽게 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 펜 실바 니 아-Nic 플래시 photolysis 5 월 1 일에서에서 사용할 수 깨어/행동 동물 소설 행동 약리학 패러다임에 니코틴의 행동을 연구.
The authors have nothing to disclose.
저자 감사 다음 북서부 주 수 사관 들의 실험실 구성원: Ryan Drenan, D. 제임스 Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy, 그리고 Anis 계약자. 이 작품은 미국 국립 보건원 (NIH) (보조금 DA035942와 R.M.D. DA040626), PhRMA 재단 (친목 M.C.A.), 그리고 HHMI에 의해 지원 되었다.
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |