अलगाव और भ्रूण माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति
Summary
यहां, हम ई13 माउस भ्रूण ganglionic उभार से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपंयास microsurgical तकनीक परिचय ।
Abstract
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) multipotent है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के तीन प्रमुख कोशिका प्रकार को जंम दे सकते हैं । इन विट्रो में संस्कृति और एनएससी के विस्तार neuroscientists के लिए कोशिकाओं का एक उपयुक्त स्रोत प्रदान करने के लिए न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के समारोह के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन. वयस्क या भ्रूण स्तनधारी दिमाग से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए कई तकनीक की सूचना दी । भ्रूण सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों से एनएससी को अलग करने के लिए microsurgical आपरेशन के दौरान, यह जीवित और विस्तार योग्य स्टेम कोशिकाओं के उच्चतम अनुपात प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क की कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । माउस भ्रूण मस्तिष्क से इन कोशिकाओं के अलगाव के दौरान तनाव में कमी के लिए एक संभव तकनीक शल्य चिकित्सा समय की कमी है । यहां, हम ई13 माउस भ्रूण ganglionic उभार से इन कोशिकाओं के तेजी से अलगाव के लिए एक विकसित तकनीक का प्रदर्शन । सर्जिकल प्रक्रियाओं ई गर्भाशय से13 चूहे भ्रूण कटाई शामिल हैं, एक तुला सुई टिप के साथ भ्रूण के ललाट ब्रह्मारंध्र काटने, खोपड़ी से मस्तिष्क निकालने, अलग मस्तिष्क के microdissection ganglionic उभार फसल के लिए, पृथक्करण एक सेल निलंबन हासिल करने के लिए एनएससी माध्यम में काटा ऊतक के, और अंत में निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं चढ़ाना neurospheres उत्पंन करने के लिए ।
Introduction
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) वयस्क और भ्रूण मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में रहते हैं और वे न्यूरॉन्स और glial सेल1के विभिन्न प्रकार उत्पन्न करने के लिए एक प्रवृत्ति है. subventricular जोन में वयस्क स्तनधारी ब्रेन2 और ganglionic उभार भ्रूण मस्तिष्क में एनएससी समृद्ध क्षेत्र3हैं । विकासशील मस्तिष्क में, ganglionic उभार cortical न्यूरॉन्स की सबसे अधिक बचाता है और विशेष रूप से GABAergic न्यूरॉन्स3. वहां भी कर रहे है कम इनवेसिव विधि भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) है कि पशु उपयोग के लिए मांग को कम से स्टेम कोशिका पीढ़ी के लिए । तथ्य यह है कि ESCs या iPSCs से एनएससी पैदा करने के बावजूद4संभव है,5, यह कुछ फायदे और नुकसान है तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव की तुलना में वयस्क या भ्रूण मस्तिष्क6,7से, 8. न्यूरॉन phenotypes की ओर ESCs और iPSCs के भेदभाव उत्प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल हमेशा समय और लागत लेने वाले हैं और सफलता की दर (70-80% Nestin सकारात्मक कोशिकाओं)5 पशु मस्तिष्क से एनएससी के प्रत्यक्ष अलगाव के साथ तुलना में कम है ( ९९% से अधिक Nestin धनात्मक कोशिकाएं)9. इसके अलावा, स्टेम सेल कई मार्ग10,11के बाद उनके आनुवंशिक स्थिरता और भेदभाव की प्रवृत्ति खो देते हैं । हालांकि वहां एनएससी में दैहिक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रूपांतरण के बारे में अंय नई रिपोर्ट कर रहे हैं, इन कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से इंजीनियर है और हर12प्रयोगशाला में आसानी से सुलभ नहीं हैं । इसलिए, अभी भी पशु मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक बड़ी मांग है; यह शल्य चिकित्सा तकनीक में सुधार के द्वारा पशु उपयोग की मात्रा को कम करने के लिए संभव है । शल्य चिकित्सा समय को कम करने और तकनीक में सुधार करके, कोशिकाओं को नुकसान से दूर रखने के लिए और प्रत्येक जानवर से एनएससी की उच्चतम दर प्राप्त करने के लिए संभव है ।
यहां, हम माउस ई13 भ्रूण मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरलीकृत और reproducible तकनीक परिचय ।
Protocol
Representative Results
Discussion
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एक उपयुक्त स्रोत का उपयोग neuroscientists के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं भ्रूण मस्तिष्क के विभिंन क्षेत्रों से काटा जा सकता है और वे ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के वि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रोयन् इंस्टीट्यूट ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
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