Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Max Z. Levine; Nicole E. Gregorio; Michael C. Jewett; Katharine R. Watts; Javin P. Oza

doi:10.3791/58882

Articolo metodologico

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

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DOI:

10.3791/58882

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25 febbraio 2019

Max Z. Levine^*¹^,² , Nicole E. Gregorio^*²^,³ , Michael C. Jewett⁴^,⁵^,⁶^,⁷ , Katharine R. Watts²^,³ , Javin P. Oza²^,³

¹Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ²Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, ³Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, ⁴Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, ⁵Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, ⁶Center for Synthetic Biology, Northwestern University, ⁷Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dettaglia i passaggi, i costi e attrezzature necessarie per generare e. coli-base di estratti cellulari e implementare in vitro reazioni di sintesi di proteine entro 4 giorni o meno. Per sfruttare la natura flessibile di questa piattaforma per vaste applicazioni, discutiamo le condizioni di reazione che possono essere adattate e ottimizzate.

Abstract

Negli ultimi 50 anni, sintesi di proteina Cell-Free (CFPS) è emerso come una potente tecnologia per sfruttare la capacità trascrizionale e traslazionale delle cellule all'interno di una provetta. Eliminando la necessità di mantenere la vitalità della cellula ed eliminando la barriera cellulare, CFPS è stato fondamentale per le applicazioni emergenti in bioproduzione di proteine tradizionalmente difficili, nonché applicazioni nella prototipazione rapida per Ingegneria metabolica e genomica funzionale. I nostri metodi per l'implementazione di un e. coli-piattaforma basato su CFPS ai nuovi utenti di accedere a molte di queste applicazioni. Qui, descriviamo i metodi per preparare l'estratto attraverso l'uso di media arricchita, boccette sconcertati e un metodo riproducibile di lisi cellulare basato su sonicazione sintonizzabile. Questo estratto quindi può essere utilizzato per l'espressione della proteina in grado di produrre 900 µ g/mL o più di proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP) in appena 5 ore dalla messa a punto sperimentale all'analisi dei dati, dato che le scorte di reattivo appropriato sono state preparate in anticipo. Il costo stimato avvio di ottenere reagenti è $4.500 che sosterrà migliaia di reazioni ad un costo stimato di $0,021 per µ g di proteina prodotta o $0,019 per µ l di reazione. Inoltre, i metodi di espressione della proteina specchio la facilità dell'installazione reazione visto nei sistemi disponibili in commercio a causa dell'ottimizzazione di reagente premiscelati, ad una frazione del costo. Al fine di consentire all'utente di sfruttare la natura flessibile della piattaforma CFPS per vaste applicazioni, abbiamo identificato una varietà di aspetti della piattaforma che possono essere ottimizzate e ottimizzato a seconda delle risorse disponibili e gli esiti di espressione della proteina desiderato.

Introduzione

Sintesi di proteine senza cellula (CFPS) è emerso come una tecnologia che ha sbloccato una serie di nuove opportunità per la produzione di proteine, genomica funzionale, ingegneria metabolica e più entro gli ultimi 50 anni¹^,². Rispetto alla standard in vivo piattaforme di espressione di proteine, CFPS offre tre vantaggi principali: 1) la natura senza cellula della piattaforma consente la produzione di proteine che sarebbe potenzialmente tossici o stranieri per la cella³^,⁴ ^,