Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo
Summary
Misurazione della capacità di efflusso di colesterolo in vitro di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente come biomarcatore per aterosclerosi. Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di efflusso di colesterolo-NBD fluorescente e sviluppare un’analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.
Abstract
Aterosclerosi conduce alla malattia cardiovascolare (CVD). Non è ancora chiaro se la concentrazione di colesterolo-HDL (cHDL) ha un ruolo causale nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, un fattore importante nelle prime fasi della formazione di placche di ateroma è capacità di efflusso di colesterolo di HDL (la capacità delle particelle di HDL di accettare di colesterolo dai macrofagi) al fine di evitare la formazione delle cellule della gomma piuma. Si tratta di un passaggio chiave nella evitando l’accumulo di colesterolo nell’endotelio e una parte del trasporto inverso del colesterolo (RCT) per eliminare il colesterolo attraverso il fegato. Capacità di efflusso di colesterolo di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente che può essere utilizzato come biomarcatore per aterosclerosi. Tradizionalmente, [3H]-colesterolo è stato utilizzato nelle analisi di efflusso di colesterolo. In questo studio, puntiamo a sviluppare una strategia più sicura e veloce utilizzando fluorescente etichettati-colesterolo (colesterolo-NBD) in un’analisi cellulare per rintracciare il processo di assorbimento e di efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. Infine, ottimizzare e standardizzare la metodica di efflusso di colesterolo-NBD e sviluppare un’analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.
Introduction
Secondo l’organizzazione mondiale della sanità, le correnti principali cause di morte nel mondo sono la cardiopatia ischemica e ictus (contabilità per un totale di 15,2 milioni di morti)1. Entrambe sono malattie cardiovascolari (CVD) che possono essere precedute da aterosclerosi e la rottura delle placche di ateroma nei vasi sanguigni2,3.
L’aterosclerosi è una malattia infiammatoria parete vaso in cui i macrofagi, linfociti T, mastociti e cellule dendritiche infiltrano l’endotelio e si accumulano dal sangue, alla fine formano placche aterosclerotiche. Le placche aterosclerotiche presentano un lipide cristalli core e colesterolo, evidenziati da misure di ecografia B-mode ad alta risoluzione della carotide intima media spessore4,5. Nei macrofagi, efflusso di colesterolo verso particelle lipidiche accettore è effettuato con mezzi dei recettori ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro sottofamiglia G trifosfato di adenosina 1 (ABCG1) e il recettore scavenger SR-BI. Lo squilibrio del colesterolo afflusso e deflusso nei macrofagi è considerato un processo chiave nella aterosclerosi iniziazione6. Efflusso di colesterolo è considerata un passo fondamentale nell’eliminazione del colesterolo dal tessuto periferico al plasma e nel fegato in un processo chiamato trasporto inverso del colesterolo (RCT). Colesterolo viene trasferito dai macrofagi principalmente ad apolipoproteina A1 (ApoA1) presenti sulla superficie delle particelle della lipoproteina ad alta densità (HDL). HDL trasportano quindi il colesterolo al fegato per escrezione e reimpiego7,8,9.
Tradizionalmente, colesterolo radiomarcato trizio (3H) è stato utilizzato in efflusso di colesterolo10. Il segnale di emissione dei radioisotopi è altamente sensibile10; Tuttavia, il colesterolo radiomarcato presenta evidenti svantaggi quali protocolli lunghi, rischio di esposizione a radiazioni ionizzanti e la necessità speciali radioattività strutture e attrezzature garantire l’uso sicuro dell’emissione radioattiva. Al contrario, fluorescenza è stato integrato con successo nelle tecniche diagnostiche grazie alla sua semplicità nella rilevazione del segnale fluorescente, l’ampia varietà di fluorofori disponibili e relativi di sicurezza11. Diversi steroli fluorescenti-etichettati sono stati usati per studiare il metabolismo del colesterolo compreso dehydroergosterol (con fluorescenza intrinseca), colesterolo di dansile, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – colesterolo e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-OL (NBD-colesterolo). In particolare, NBD-colesterolo presenta un assorbimento efficiente in cellule umane12. Due differenti NBD etichettati-colesterolo sono attualmente disponibili: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterolo etichettato con parte 22-NBD soddisfino al meglio gli studi di efflusso di colesterolo, mentre 25-NBD-colesterolo pricipalmente è utilizzato nella membrana cellulare dinamica ricerca13,14.
Le linee cellulari in genere utilizzate nelle analisi di efflusso di colesterolo in vitro sono cellule monocito-come ad esempio cellule THP-1 leucemia-derivate essere umano, murino 264,7 cellule15o J774.1. Tutte queste cellule possono essere differenziate in macrofagi in vitro facendo uso di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), ma THP-1-macrofagi derivati (dmTHP-1) migliori riflettono e imitano i macrofagi umani16.
Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di alto-rendimento fluorescente per determinare la capacità di efflusso di colesterolo di campioni di siero su dmTHP-1, utilizzando 22-NBD-colesterolo come alternativa a [3H]-colesterolo. Inoltre, mettiamo a confronto la tecnica fluorescente ottimizzata con l’analogico standard radioattivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fluorescenti-etichettati colesterolo è una strategia promettente per analizzare e studiare le proprietà e il metabolismo del colesterolo naturale in vitro. I suoi principali vantaggi sono che può essere preso dalle cellule, permette per intracellulare e gli studi di distribuzione di membrana e può essere applicato a dosaggi efflusso di colesterolo come in questo protocollo (Figura 7). Alcuni steroli fluorescenti-etichettati consentono colesterolo monitoraggio in vitro BODIPY-colesterolo,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di studio la ricerca FIS (PS12/00866) dall’Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; El di para di Fondo Europeo sviluppo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) e CERCA programma / Generalitat de Catalunya. Gli autori ringraziano la Retrovirology e virale Immunopathology laboratorio di progetto l’Institut Investigacions agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Ringraziamo Escribà T., c. Rovira e C. Hurtado per la loro assistenza e S. Cufí dalla conoscenza e dall’ufficio di trasferimento tecnologico per la sua guida nel proteggere l’invenzione.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Riferimenti
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
