High-throughput Nitrobenzoxadiazole-märkt kolesterol Efflux Assay
Summary
Mätning av in vitro-kolesterol efflux kapacitet att serum eller plasma i makrofag cellmodeller är ett lovande verktyg som en biomarkör för åderförkalkning. I den aktuella studien, vi optimera och standardisera en fluorescerande NBD-kolesterol efflux metod och utveckla en hög genomströmning analys med 96 brunnar.
Abstract
Åderförkalkning leder till hjärt-kärlsjukdom (CVD). Det är fortfarande oklart om kolesterolet-HDL (cHDL) koncentration spelar en kausal roll i utveckling av åderförkalkning. Men en viktig faktor i tidigt skede av aterom plack är kolesterol efflux kapacitet att HDL (HDL partiklar förmåga att acceptera kolesterol från makrofager) för att undvika skum cellnybildningen. Detta är ett viktigt steg i att undvika ansamling av kolesterol i endotelet och en del av omvänd kolesterol transport (RCT) för att eliminera kolesterol genom levern. Kolesterol efflux kapacitet att serum eller plasma i makrofag cellmodeller är ett lovande verktyg som kan användas som biomarkör för åderförkalkning. Traditionellt, [3H]-kolesterol har använts i kolesterol efflux analyser. I denna studie, vi strävar efter att utveckla en strategi för säkrare och snabbare som använder fluorescerande märkt-kolesterol (NBD-kolesterol) i en cellulär analysen att spåra kolesterol upptag och efflux processen i THP-1-härledda makrofager. Slutligen, vi optimera och standardisera metoden NBD-kolesterol efflux och utveckla en hög genomströmning analys med 96 brunnar.
Introduction
Enligt Världshälsoorganisationen är nuvarande huvudsakliga dödsorsakerna över hela världen ischemisk hjärtsjukdom och stroke (redovisning för totalt 15,2 miljoner dödsfall)1. Båda är hjärt-kärlsjukdom (CVD) som kan föregås av åderförkalkning och bristning av aterom plack i blodkärlen2,3.
Åderförkalkning är en fartyget vägg inflammatorisk sjukdom där makrofager, T-celler, mastceller och dendritiska celler infiltrera endotelet och ackumuleras från blodet, så småningom bilda aterosklerotiska plack. Aterosklerotiska plack presenterar en lipid core och kolesterol kristaller, framgår av högupplösta B-mode ultraljud mätningar av den carotid intima-media tjocklek4,5. I makrofager utförs kolesterol efflux mot lipid acceptor partiklar med medel av ATP-bindande kassett (ABC) receptorer ABCA1, ATP bindande kassett underfamilj G medlem 1 (ABCG1), och gatsopare receptorn SR-BI. Obalansen av kolesterol inflödet och utflödet i makrofager anses vara en viktig process i åderförkalkning inledande6. Kolesterol efflux anses vara ett viktigt steg i kolesterol elimination från perifer vävnad till plasma och lever i en process som kallas omvänd kolesterol transport (RCT). Kolesterol är överförs från makrofager främst till apolipoprotein A1 (ApoA1) finns på ytan av high-density lipoprotein (HDL) partiklar. HDLs sedan transporterar kolesterol till levern för utsöndring och återanvändning7,8,9.
Tritium (3H) isotopmärkt kolesterol har traditionellt använts i kolesterol efflux10. Utsläpp signalen av radioisotoper är mycket känsliga10; isotopmärkt kolesterol presenterar emellertid uppenbara nackdelar såsom lång protokoll, risk för exponering för joniserande strålning och behovet av särskilda radioaktivitet faciliteter och utrustning för att garantera säker hantering av radioaktivt utsläpp. Tvärtom, har fluorescens integrerats framgångsrikt i diagnosmetoder tack vare sin enkelhet i fluorescerande signaldetektion, en stor mängd fluorophores tillgänglig och dess säkerhet11. Flera lysrör-märkt växtsteroler har använts för att studera kolesterol metabolism inklusive dehydroergosterol (med inneboende fluorescens), dansyl kolesterol, 4,4-difluor-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – kolesterol och 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-kolesterol). Särskilt, presenterar NBD-kolesterol ett effektivt upptag i mänskliga celler12. Två olika NBD märkt-kolesterol är för närvarande tillgängliga: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) och 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; (Se figur 1). Kolesterol märkt med 22-NBD biexponentiellt kan bäst passa kolesterol efflux studier, medan 25-NBD-kolesterol används främst i cellulära membran dynamics forskning13,14.
Cellinjer som normalt används i in vitro-kolesterol efflux analyser är monocyt-liknande celler såsom mänskliga leukemi-derived THP-1 celler, murina Raw 264,7 celler15eller J774.1. Alla dessa celler kan differentieras till makrofager i vitro använder phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA), men THP-1-härledda makrofager (dmTHP-1) bästa reflektera och efterlikna det mänskliga makrofager16.
I den aktuella studien, vi optimera och standardisera en fluorescerande hög genomströmning metod för att bestämma kolesterol efflux kapacitet serumprover på dmTHP-1, med 22-NBD-kolesterol som ett alternativ till [3H]-kolesterol. Dessutom jämför vi optimerade fluorescerande tekniken med standard radioaktiva analog.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lysrör-märkt kolesterol är en lovande strategi för att analysera och undersöka egenskaper och metabolismen av naturliga kolesterol in vitro. Dess främsta fördelar är att det kan tas upp av celler, möjliggör intracellulära och membran distributionsstudier, och kan tillämpas på kolesterol efflux analyser såsom i detta protokoll (figur 7). Vissa lysrör-märkt steroler tillåta kolesterol spårning in vitro-inklusive BODIPY-kolesterol, dansyl-kolesterol, dehydroegrosterol och 22 -…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har varit delvis stöds av forskningen ger FIS (PS12/00866) från Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanien. Fondo Europeo para el Desarrollo regionala (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) och CERCA programmet / Generalitat de Catalunya. Författarna tackar Retrovirology och Viral Immunopathology laboratorium av den Institut d’Investigacions Biomèdiques augusti Pi I Sunyer (IDIBAPS). Vi tackar T. Escriba, C. Rovira och C. Hurtado för deras stöd och S. Cufí kunskap och teknologi Transfer Office för henne vägledning i skydd av uppfinningen.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Riferimenti
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
