בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר
Summary
Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת”myovascular”.
Abstract
תאי אנדותל של הנימים שרירי השלד (microvascular אנדותל תאי שריר, MMEC) לבנות את המכשול בין זרם הדם שרירי השלד ויסות חילופי נוזלים, חומרים מזינים, כמו גם את התגובה החיסונית נגד זיהומיות סוכנים על ידי שליטה נדידת תאים חיסוניים. עבור פונקציות אלה, MMEC יוצרים פונקציונלי “יחידה myovascular” (MVU), עם סוגי תאים נוספים, כגון fibroblasts, pericytes, תאי שריר השלד. כתוצאה מכך, תפקוד MMEC ולכן MVU את תורמת למגוון עצום של myopathies. אולם, מנגנוני הרגולציה של MMEC על בריאות ומחלה נותרו מספיק מובן, הבהרה שלהם מקדים טיפולים פרטניים יותר myopathies. בידוד של חקירה מעמיקה של פונקציות MMEC העיקרי בהקשר של MVU עשוי להקל על הבנה טובה יותר של תהליכים אלה.
מאמר זה מספק פרוטוקול כדי לבודד MMEC מאתר העיקרי של שריר השלד מאת דיסוציאציה מכני, אנזימטי כולל טיהור והשלבים תחזוקה תרבות.
Introduction
דרך מחזור הדם, תאים ואיברים, מסופקים עם חמצן, מצעים, מולקולות אחרות הדרושות. מחלף זה מתרחש בנימים, בכלי הדם הקטנים. נימים נוצרות על ידי שכבת תאי אנדותל הפנימי (EC) שלמות אשר נשאר תנאי לביצוע מוצלח ההסדרה של הומאוסטזיס שריר בין המרחב קרישה תוך-כלית, interstitial. כדי להבטיח מעבר סלקטיבי של גורמים מסיסים ותאים, EC מהוות של טפט מחוברים על ידי חזק צמתי adherens 1. מלבד תפקידה כמחסום חומרים מזינים או מוצרים מטבולית, EC לווסת את גיוס לויקוציטים בתהליכים דלקתיים. נזק דלקת או רקמה מוביל למעלה-רגולציה של מולקולות אדהזיה על פני EC ו ייצור של נוגדנים הקלת ליקוציט המצורף, גלגול לתוך רקמת המטרה 2. כתוצאה מכך, EC אנושות מעורבים בוויסות תהליכים דלקתיים כגון ההגנה נגד פתוגנים או רקמות תיקון.
תפקוד EC הוא ישירות הקשורים עם מחלות לב וכלי דם, אי ספיקת כליות כרונית, פקקת ורידים חמורה הפתוגן זיהומים. יתר על כן, EC כמעט תמיד מעורבים מחלת חיסון עצמי ייחודיים כגון סוכרת או טרשת נפוצה 3. הפונקציה מחסום בין זרם הדם ואיברים ולכן נשלטת על ידי המרצד מתואמת סוגי תאים שונים. בתאי שריר השלד microvascular אנדותל (MMEC) יחד עם תאי שריר, fibroblasts ו pericytes יוצרות יחידה פונקציונלית, יחידת”myovascular” (MVU). לכן, תפקוד MVU עשוי לשחק תפקיד קריטי הפתופיזיולוגיה של myopathies. אולם, הבנה עמוקה יותר של מנגנונים רגולטוריים אלה עדיין נעדר, כיום מונע זיהוי מטרות חדשות, בדחיפות, טיפולי myopathies.
כדי לחקור את המנגנונים הפיזיולוגיים ואת pathophysiological מורכבים, מודלים בעלי חיים משמשים. עם זאת, מודלים במבחנה מציעים היתרון להתמקד על נושא מעניין על ידי למעט מגוון גורמים מבלבלים. לחקור תהליכי הפריה זה הכרחי בידוד תאי יסוד טהור בר -קיימא. בניגוד שורות תאים, התאים הראשי שבודדו מבעלי הטרנסגניים מאפשרים לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים במבחנה.
. הנה, שיטה לבודד את ראשי MMEC מאתר מתואר באמצעות דיסוציאציה מכני, אנזימטי ואחריו מגנטי תא מופעל מיון טכניקות (MCS) לטיהור. למטרה זו, משמשים beads מגנטי נגד סמני פני שטח מסוים. טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה-1 (PECAM1, CD31), מתבטאת בעיקר על EC והוא יכול לשמש כדי להעשיר את סוג התא. כדי להצדיק טוהר גבוהה תא, תאים ממוצא hematopoietic יוצאו על ידי בחירה שלילי עבור סוג קולטן טירוזין phosphatase חלבון C (PTPRC, CD45). בהמשך, מוצגים פקדים איכות, טיפוח של MMEC מאתר ראשי, יישומים פוטנציאליים, מגבלות, כמו גם שיקולים מיוחדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microvascular תאי אנדותל לספק פונקציות מכשול ברקמות כל התוצאות שלהם לקוי במחלה של האיברים הקשורים 3. יתר על כן, מחקרים ייחודיים של microvascular EC יכול לסלול את הדרך עבור אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, הבנה עמוקה יותר של microvascular EC תפקוד בתנאים פיזיולוגיים, הקשורים pathophysiological הוא עניין מדעי ר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי “אחר Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 ל יח), “חדשני Medizinische Forschung (קרן המטבע) מינסטר” (I-RU211811 כדי TR) וקרן מחקר גרמני (DFG, מוסד 2105/27-1, לי 3283/5-1 ולי 3283/6-1 כדי SGM). תמונות מאויר שסופקו על-ידי האיקה בלום.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Riferimenti
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
