प्राथमिक मुरीन कंकाल की मांसपेशी microvascular एंडोथीलियल कोशिकाओं के अलगाव
Summary
कंकाल की मांसपेशियों की माइक्रोसंवहनी एंडोथीलियल कोशिकाओं (mmec) मांसपेशी केशिकाओं की भीतरी दीवार को आकार और दोनों को विनियमित, तरल पदार्थ के आदान-प्रदान/अणुओं और मांसपेशियों के ऊतकों और रक्त के बीच (प्रतिरक्षा) कोशिकाओं के प्रवास । प्राथमिक मुरीन mmec का अलगाव, जैसा कि यहां वर्णित है, “मायोवैस्कुलर यूनिट” के विट्रो जांच में व्यापक सक्षम बनाता है ।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी केशिकाओं की endothelial कोशिकाओं (मांसपेशी microvascular एंडोथेलियल कोशिकाओं, mmec) रक्त प्रवाह और कंकाल की मांसपेशियों के बीच बाधा का निर्माण तरल पदार्थ और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान के साथ ही संक्रामक के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एजेंटों प्रतिरक्षा सेल प्रवास को नियंत्रित करने के द्वारा । इन कार्यों के लिए, mmec एक कार्यात्मक “मायोवैस्कुलर यूनिट” (mvu), आगे के सेल प्रकारों के साथ, जैसे कि फाइब्रोब्लास्ट, पेरिसाइट्स और कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के रूप में । नतीजतन, mmec की शिथिलता और इसलिए mvu myopathies की एक विशाल विविधता के लिए योगदान देता है । हालांकि, स्वास्थ्य और रोग में mmec के विनियामक तंत्र अपर्याप्त रूप से समझ में आता है और उनके आविर्तन मायोपेथिस के लिए और अधिक विशिष्ट उपचार से पछाड़ । अलगाव और mvu के संदर्भ में प्राथमिक mmec कार्यों की गहराई से जांच इन प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ की सुविधा हो सकती है ।
यह लेख शुद्धिकरण और संस्कृति के रखरखाव के कदमों सहित यांत्रिक और एंजाइमेटिक वियोजन द्वारा कंकाल की मांसपेशी के प्राथमिक मुरीन mmec को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।
Introduction
रक्त प्रवाह के माध्यम से, कोशिकाओं और अंगों ऑक्सीजन, substrates और अन्य आवश्यक अणुओं के साथ आपूर्ति की जाती है । यह विनिमय capillaries, छोटी जहाजों में जगह लेता है । capillaries एक भीतरी endothelial कोशिका (ईसी) परत जिसका अखंडता intravascular और अंतरालीय अंतरिक्ष के बीच मांसपेशी homeostasis के सफल नियमन के लिए एक शर्त बनी हुई है द्वारा बनाई गई हैं । घुलनशील कारकों और कोशिकाओं के एक चयनात्मक संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, चुनाव आयोग एक तंग और पंना जंक्शन 1द्वारा परस्पर monolayer का गठन । पोषक तत्वों या चयापचय उत्पादों के लिए बाधा के रूप में अपनी भूमिका के अलावा, चुनाव आयोग भड़काऊ प्रक्रियाओं में ल्यूकोसाइट्स की भर्ती को विनियमित । सूजन या ऊतक क्षति के लिए एक अप-चुनाव आयोग की सतह पर आसंजन अणुओं के विनियमन और ल्यूकोसाइट लगाव को सुविधाजनक बनाने के chemokines के उत्पादन और लक्ष्य ऊतक 2में स्थानांतरगमन की ओर जाता है । नतीजतन, चुनाव आयोग गंभीर रूप से इस तरह के रोगजनकों या ऊतक की मरंमत के खिलाफ रक्षा के रूप में भड़काऊ प्रक्रियाओं के नियमन में शामिल हैं ।
चुनाव आयोग की शिथिलता सीधे संवहनी रोगों, क्रोनिक गुर्दे की विफलता, शिरापरक थ्रोम्बोसिस गंभीर रोगज़नक़ संक्रमण के साथ जुड़ा हुआ है । इसके अलावा, चुनाव आयोग वस्तुतः हमेशा ऐसे मधुमेह मेलिटस या मल्टीपल स्केलेरोसिस 3के रूप में अंग विशेष autoimmunity में शामिल हैं । रक्त प्रवाह और अंगों के बीच बाधा समारोह इसलिए अलग सेल प्रकार के एक ठोस परस्पर क्रिया द्वारा नियंत्रित किया जाता है । कंकाल की मांसपेशी microvascular एंडोथेलियल कोशिकाओं में (mmec) मांसपेशी कोशिकाओं के साथ साथ, फाइब्रोब्लास्ट और pericytes एक कार्यात्मक इकाई के रूप में, “मायोवैस्कुलर यूनिट” (mvu). इसलिए, mvu की शिथिलता myopathies की पैथोफिजियोलॉजी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । हालांकि, इन नियामक तंत्र की एक गहरी समझ अभी भी लापता है और वर्तमान में नए की पहचान precludes, तत्काल की जरूरत है, myopathies में चिकित्सीय लक्ष्यों ।
जटिल शारीरिक और pathophysiological तंत्र की जांच करने के लिए, पशु मॉडल आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है । तथापि, इन विट्रो मॉडल में लाभ की पेशकश करने के लिए कई conसंस्थापकों की एक किस्म को छोड़कर ब्याज के विषय पर ध्यान केंद्रित । विट्रो में प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए यह शुद्ध और व्यवहार्य प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक है । कोशिका रेखाओं के विपरीत, ट्रांसजेनिक जंतुओं से पृथक प्राथमिक कोशिकाएं विट्रो में आनुवंशिक संशोधनों के परिणामों की जांच करने में सक्षम होती हैं ।
यहाँ, एक विधि को अलग करने के लिए प्राथमिक murine mmec यांत्रिक और एंजाइमी पृथक्करण का उपयोग करके वर्णित है चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई तकनीक (mcs) शुद्धि के लिए बाद. इस प्रयोजन के लिए, विशिष्ट सतह मार्कर के खिलाफ चुंबकीय मोती का उपयोग किया जाता है । प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु-1 (PECAM1, CD31) मुख्य रूप से चुनाव आयोग पर व्यक्त की है और इस सेल प्रकार को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उच्च सेल शुद्धता वारंट करने के लिए, हेमटोपोइटिक मूल की कोशिकाओं प्रोटीन tyrosine फॉस्फाटेस रिसेप्टर प्रकार सी के लिए एक नकारात्मक चयन से बाहर रखा गया है (ptprc, CD45). इसके अलावा, गुणवत्ता नियंत्रण, प्राथमिक मूरीन mmec की खेती, संभावित अनुप्रयोगों और सीमाओं के साथ ही विशेष विचार प्रस्तुत कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोसंवहनी endothelial कोशिकाओं सभी ऊतकों में बाधा कार्य प्रदान करते हैं और संबंधित अंगों की बीमारी में उनके रोग परिणाम 3. इसके अलावा, माइक्रोवैस्कुलर ईसी के अंग-विशिष्ट अध्ययन नई चिकित्सीय रणनी?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था “और kröner-फ्रेनिअस-stiftung” (2018_a03 करने के लिए TR), “अभिनव medizinische forschung अंतरराष्ट्रीय मुद्रा कोष () münster” (I-RU211811 से TR) और जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (dfg, 2105/27-1 inst, मुझे 3283/5-1, और मुझे 3283/6-1 sgm के लिए) । सचित्र heike blum द्वारा प्रदान की छवियां ।
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Riferimenti
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