Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico
Summary
Cellule endoteliali microvascolari dei muscoli scheletrici (MMEC) forma la parete interna dei vasi capillari del muscolo e regolano entrambi, scambio di fluidi/molecole e migrazione delle cellule (immuni) tra sangue e tessuto muscolare. Isolamento di MMEC murino primario, come descritto qui, consente indagini complete in vitro del “unità myovascular”.
Abstract
Le cellule endoteliali dei capillari del muscolo scheletrico (muscolo cellule endoteliali microvascolari, MMEC) costruire la barriera tra sangue e nei muscoli scheletrici che regolano lo scambio di fluidi e sostanze nutrienti, nonché la risposta immunitaria contro infettive agenti di controllo della migrazione delle cellule immuni. Per queste funzioni, MMEC formano un funzionale “unità myovascular” (MVU), con altri tipi di cellule, come fibroblasti, periciti e cellule muscolari scheletriche. Di conseguenza, una disfunzione di MMEC e di conseguenza il MVU contribuisce a una vasta varietà di miopatie. Tuttavia, meccanismi regolatori di MMEC nella salute e nella malattia rimangono insufficientemente capiti e loro delucidazione precede trattamenti più specifici per miopatie. L’isolamento e l’indagine approfondita delle funzioni primarie di MMEC nel contesto del MVU potrebbe agevolare una migliore comprensione di questi processi.
Questo articolo fornisce un protocollo per isolare MMEC murino primario del muscolo scheletrico di dissociazione meccaniche ed enzimatiche, tra cui purificazione e operazioni di manutenzione di cultura.
Introduction
Organi, cellule e via flusso sanguigno sono forniti con ossigeno, substrati e altre molecole necessarie. Questo interscambio avviene nei capillari, i vasi più piccoli. I capillari sono formati da uno strato interno delle cellule endoteliali (CE) cui integrità rimane un prerequisito per il successo regolazione dell’omeostasi del muscolo tra lo spazio intravascolare e interstiziale. Per garantire una transizione selettiva di cellule e fattori solubili, CE costituiscono un monostrato collegati tra loro da stretti e adherens junctions 1. Oltre il suo ruolo come barriera per le sostanze nutrienti o prodotti metabolici, CE regolano il reclutamento dei leucociti nei processi infiammatori. Infiammazione o tessuto danno conduce ad un su-regolamento delle molecole di adesione sulla superficie CE e la produzione di chemochine facilitare l’attaccamento del leucocita e trasmigrazione nei tessuti target 2. Di conseguenza, CE criticamente sono coinvolti nella regolazione dei processi infiammatori quali la difesa contro gli agenti patogeni o riparazione dei tessuti.
Una disfunzione della CE è direttamente connesso con le malattie vascolari, insufficienza renale cronica, trombosi venosa grave patogeno infezioni. Inoltre, CE sono praticamente sempre coinvolti nell’autoimmunità organo-specifiche come diabete mellito o sclerosi multipla 3. La funzione di barriera tra sangue e organi è quindi controllata da un’interazione concertata dei diversi tipi di cellule. Nel muscolo scheletrico cellule endoteliali microvascolari (MMEC) insieme alle cellule muscolari, fibroblasti e periciti formano un’unità funzionale, l’unità di”myovascular” (MVU). Pertanto, una disfunzione del MVU possa giocare un ruolo critico nella fisiopatologia delle miopatie. Tuttavia, una più profonda comprensione di questi meccanismi regolatori è ancora manca e attualmente preclude l’identificazione di bersagli di nuovi, urgente, terapeutici in miopatie.
Per studiare i complessi meccanismi fisiologici e fisiopatologici, modelli animali sono comunemente usati. Tuttavia, in vitro modelli offrono il vantaggio di concentrarsi sull’argomento di interesse escludendo una varietà di fattori di confondimento. Per studiare processi in vitro è necessario isolare cellule primarie pure e vitale. In contrasto con linee cellulari, cellule primarie isolate da animali transgenici permettono di studiare le conseguenze delle modificazioni genetiche in vitro.
Qui, un metodo per isolare MMEC murino primario è descritto mediante dissociazione meccanica ed enzimatica, seguita da magnetico cella attivato ordinamento tecniche (MCS) per la purificazione. Per questo scopo, vengono utilizzati biglie magnetiche contro specifici marcatori di superficie. Piastrinica endoteliale delle cellule adesione molecule-1 (PECAM1, CD31) è espresso principalmente su CE e può essere utilizzato per arricchire questo tipo di cella. Nell’ottica di garantire purezza elevata delle cellule, cellule di origine ematopoietica sono esclusi da una selezione negativa per proteina tirosina fosfatasi recettore di tipo C (PTPRC, CD45). Inoltre, controlli di qualità, la coltivazione di primaria MMEC murino, potenziali applicazioni e limitazioni, nonché considerazioni speciali sono presentati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellule endoteliali microvascolari forniscono funzioni di barriera in tutti i tessuti e i loro risultati di disfunzione nella malattia di organi associati 3. Inoltre, gli studi di organo-specifici di microvascolare CE potrebbero spianare la strada per nuove strategie terapeutiche. Di conseguenza, una più profonda comprensione della funzione microvascolare CE in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è di grande interesse scientifico. Modulazione dell’interazione leucocita/endotelio è utiliz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal “altro Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 a TR), “Innovative Medizinische Forschung (FMI) Münster” (I-RU211811 a TR) e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 e ME 3283/6-1 a SGM). Immagini illustrate fornite da Heike Blum.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Riferimenti
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
