Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon
Summary
Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar “myovascular birimi” sağlar.
Abstract
İskelet kas kılcal damarlar (kas mikrovasküler endotel hücreleri, MMEC) endotel hücrelerinin kan akışı ve iskelet kasları bulaşıcı karşı immün yanıt yanı sıra sıvı ve besin alışverişini düzenleyen arasındaki bariyeri oluşturmak ajanlar bağışıklık hücre geçiş kontrol ederek. Bu işlevler için MMEC şeklinde bir işlevsel “myovascular birimi” (MVU), fibroblastlar, perisitlerden ve iskelet kas hücreleri gibi daha fazla hücre tipleri ile. Sonuç olarak, bir işlev bozukluğu MMEC ve bu nedenle MVU myopathies geniş bir çeşitlilik katkıda bulunur. Ancak, MMEC düzenleyici mekanizmaları sağlık ve hastalığında yeterince anlaşılır kalır ve onların aydınlatma daha spesifik tedaviler myopathies için önce. Yalıtım ve MVU bağlamında birincil MMEC fonksiyonların derinlemesine soruşturma bu süreçlerin daha iyi bir anlayış dahakolaylaştırabilirdi.
Bu makalede birincil fare MMEC iskelet kas arıtma ve kültür bakım adımlar da dahil olmak üzere mekanik ve enzimatik ayrılma tarafından yalıtmak için bir protokol sağlar.
Introduction
Kan yolu ile hücre ve organların oksijen, yüzeyler ve gerekli diğer molekülleri ile sağlanır. Bu değişim kılcal damarlar, en küçük gemiler yer alır. Kılcal damarlar kas homeostazı intravasküler ve interstisyel alanı arasında başarılı düzenlenmesi için bir ön koşul olan bütünlüğü kalır bir iç endotel hücre (EC) tabaka meydana gelir. EC çözünür faktörler ve hücrelerin seçici bir geçiş sağlamak için bir tarafından sıkıca birbirine monolayer ve adherens kavşaklar 1oluşturmaktadır. Besin veya metabolik ürünler için engel olarak rolünü yanı sıra, EC düzenleyen lökosit inflamatuar süreçlerde alımı. İltihap veya doku hasarı için adezyon moleküllerinin bir up-yönetmelik EC yüzey ve lökosit eki ve Hicret hedef doku 2içine kolaylaştıran kemokinler üretimine yol açar. Sonuç olarak, EC eleştirel söz konusu olursa patojenleri ya da doku tamiri karşı savunma gibi iltihabi süreçleri düzenlenmesi.
EC disfonksiyon doğrudan olduğunu vasküler hastalıklar, kronik böbrek yetmezliği, Venöz tromboz ağır patojen enfeksiyonları ile ilişkili. Ayrıca, EC hemen hemen her zaman söz konusu olursa organ özgü otoimmünite diabetes mellitus veya multipl skleroz 3gibi. Kan akışı ve organları arasında bariyer fonksiyonu bu nedenle farklı hücre türleri uyumlu bir etkileşim tarafından kontrol edilir. İskelet kas mikrovasküler endotel hücrelerinde (MMEC) ile birlikte kas hücreleri, fibroblastlar ve perisitlerden fonksiyonel ünitesi, “myovascular ünitesi” formu (MVU). Bu nedenle, işlev bozukluğu MVU myopathies Patofizyoloji kritik bir rol oynamaktadır. Ancak, düzenleyici mekanizmaların daha derin bir anlayış hâlâ kayıp ve şu anda myopathies yeni, acilen gerekli, tedavi hedefleri tanımlaması engellemektedir.
Karmaşık fizyolojik ve patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için hayvan modelleri yaygın olarak kullanılır. Ancak, vitro modelleri faiz konusunda çeşitli karıştırıcı etkenlere hariç tutarak odaklanmak için avantaj sunuyor. Süreçleri araştırmak için tüp bebek bu saf ve uygun Primer hücre izole etmek gereklidir. Aksine hücre hatları, Primer hücre Transjenik hayvanlar izole genetik değişiklikler tüp bebek sonuçlarını araştırmak için etkinleştirin.
Burada, birincil fare MMEC izole etmek için bir yöntem mekanik ve enzimatik ayrışma teknikleri (MCS) arıtma için sıralama manyetik aktif hücre ardından kod sayfası kullanılmıştır. Bu amaçla, manyetik boncuklar belirli yüzey işaretleyicileri karşı kullanılır. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1, CD31) EC sayılı esas olarak ifade edilir ve bu hücre tipi zenginleştirmek için kullanılabilir. Yüksek hücre saflık emri için hücreleri hematopoetik kökenli bir negatif seçim tarafından için protein tirozin fosfataz reseptör tip C (PTPRC, CD45) hariç tutulur. Ayrıca, kalite denetimleri, birincil fare MMEC, potansiyel uygulamalar ve sınırlamalar yanı sıra özel hususlar ekimi sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrovasküler endotel hücreleri bariyer işlevleri tüm dokularda ve ilişkili organları 3hastalığında disfonksiyon sonuçları sağlar. Ayrıca, organ özel çalışmalar mikrovasküler EC yeni tedavi stratejileri için önünü açabilir. Bu nedenle, mikrovasküler EC işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında daha derin bir anlayış büyük bilimsel ilgi. Modülasyon lökosit/endotel etkileşim başarıyla natalizumab, lenfosit yapışma önleyen bir antikor multipl skleroz …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser “başka Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından” desteklenmiştir (TR 2018_A03), “Yenilikçi Medizinische Forschung (IMF) Münster” (ı-RU211811 TR için) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG, INST 2105/27-1, bana 3283/5-1 ve bana 3283/6-1’e SGM). Heike Blum tarafından sağlanan resimli görüntüler.
Materials
| 0,25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | ready to use |
| ACK buffer | 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3 | ||
| Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) | Biolegend | 102506 | Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl |
| Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) | Biolegend | 103106 | Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| CD31 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| CD45 MicroBeads mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Collagenase-Dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
| Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates | Corning | 3516 | |
| Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody | dianova | 712-166-153 | |
| DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) | Thermo Fisher | P36935 | |
| Desoxyribonuclease | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
| Diethylpyrocarbonat treated water | Thermo Fisher | AM9916 | |
| DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate | Thermo Fisher | 31966-021 | warm up to 37 °C before use |
| dNTP Mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | 1 mL |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| FACS tubes | Sarstedt | 551,579 | |
| Falcon 70 μm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| FC buffer | 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps (serrated, straight, 12 cm) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) | Braun | 9161708V | |
| large magnetiv columns (LS columns) | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for CD45-MACS-step |
| MCS buffer | 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2 | ||
| Medium magnetic column (MS column) | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for CD31-MACS-step |
| Nuclease free water | Thermo Fisher | R0581 | |
| PBS | Sigma Aldrich | Phosphate buffered saline, ready to use | |
| PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | in a kit with the reverse transcriptase |
| Pecam1 rat α-mouse | SantaCruz | Sc-52713 | 100 µg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| primary murine muscle cells | celprogen | 66066-01 | |
| Primer Cdh15 (M-Cadherin) | Thermo Fisher | Mm00483191_m1 | FAM labeled |
| Primer Cldn5 (claudin-5) | Thermo Fisher | Mm00727012_s1 | FAM labeled |
| Primer Ocln (occludin) | Thermo Fisher | Mm00500912_m1 | FAM labeled |
| Primer Pax-7 | Thermo Fisher | Mm01354484_m1 | FAM labeled |
| Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) | Thermo Fisher | Mm00493699_m1 | FAM labeled |
| Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) | Thermo Fisher | 4310893E | VIC labeled |
| qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher | K0231 | 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each |
| Random mixture of single-stranded primer | Thermo Fisher | SO142 | Random Hexamer Primer |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) | Thermo Fisher | EP0742 | |
| Rnase Inhibitor (40 U/μL) | Thermo Fisher | EO0381 | |
| Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Speed Coating solution | PeloBiotech | PB-LU-000-0002-00 |
Riferimenti
- Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
- Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
- Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
- Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
- Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
- Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
- Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
- Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
- Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
- Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
- Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
- Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
- Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
- Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
