Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.
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Articolo metodologico
Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo scopo di questo metodo è quello di misurare l'attività proteolitica dei campioni biologici complessi. I campioni sono separati dal peso molecolare tramite l'elettroforesi attraverso un gel di risoluzione incorporato con un substrato degradabile. Questo metodo si differenzia dal tradizionale gel zymography in quanto un peptide fluorogenico estiguuto covalentemente incorporò il gel di risoluzione invece di proteine integrale, come gelatina o caseina. Uso dei peptidi fluorogenici consente il rilevamento diretto di attività proteolitica senza ulteriori passaggi di colorazione. Gli enzimi all'interno i campioni biologici fendono il peptide fluorogenico estiguuto, conseguente a un aumento di fluorescenza. Il segnale fluorescente nel gel è allora imaged con uno scanner standard del gel fluorescente e quantificati tramite densitometria. L'uso di peptidi come il substrato degradabile espande notevolmente le possibili proteasi rilevabile con le tecniche di zymographic.
Introduzione
Zymography gel è una tecnica biologica utilizzata per misurare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici, quali fluidi corporei o delle cellule di coltura1,2,3. I campioni sono separati dai loro pesi molecolari con l'elettroforesi attraverso un gel di poliacrilammide incorporato con un substrato degradabile. I substrati degradabili comuni includono gelatina, caseina, collagene ed elastina, che sono stati utilizzati per misurare l'attività delle metalloproteinasi di matrice (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, oltre ad una varietà di catepsine1....
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Protocollo
1. preparazione di strato di Gel di risoluzione
- Preparare un poliacrilammide 10% Risoluzione soluzione di gel come da tabella 1. Aggiungere il tetrametiletilendiammina (TEMED) e l'ammonio persolfato (APS) immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.
- Riempire un vassoio del mini-gel vuoto 1,5 mm a metà strada (5 mL) con la soluzione di gel di risoluzione 10%.
- Aggiungere uno strato sottile di isopropanolo (~ 500 µ l) nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un livello gel e prevenire bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere t....
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Risultati
Utilizzando il metodo descritto qui, due peptidi di proteasi-degradabile fluorescenti sono state incorporate in gel di poliacrilammide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abbreviato come QGIW in tutto il testo e le figure) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abbreviato come LACW in tutto il testo e le figure). ↓ indica il sito di clivaggio. QGIW è un collagene-I derivati sequenza progettato per rilevare le collagenasi cellulare14. LACW è una sequenza che.......
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Discussione
Le attuali tecniche di zymographic si affidano l'incorporazione di substrati nativi in gel di poliacrilammide per la rilevazione di proteolisi. Mentre queste tecniche hanno raccolto l'uso molto diffuso, sono ancora limitati nel numero di proteasi che sono in grado di rilevare. Qui, un protocollo è stato descritto in quali peptidi fluorescenti, proteasi-degradabile sono incorporate la risoluzione di gel di poliacrilammide. Covalente accoppiamento usando una molecola del linker azido-PEG3-maleimide consente la separazione .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Finanziamento fornito da The Ohio State University College of Engineering, dipartimento di ingegneria biomedica e il Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital e Richard J. Solove Research Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cassette di gel vuote da 1,5 mm | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| Pettini per cassette di gel vuote da 1,5 mm, 10 pozzetti | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x soluzione salina tamponata con fosfato | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Soluzione SDS al 20% | Ambion | AM9820 | |
| 3x tampone per campioni per zimografia | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (p/v) Acrilammide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| Piastre per colture tissutali a 6 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimmide Kit | Clicca sulla chimica Strumenti | AZ107 | |
| Cloruro di calcio | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimetil solfossido | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanolo | Fisher Scientific | A416P | |
| Kit di analisi delle proteine Micro BCA | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N' -Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Alimentatore di base | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| Aghi ipodermici PrecisionGlide | Scientific | 14-826 | |
| Pallone a fondo tondo (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Tappo in gomma del setto | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Siringa sterile con punta scorrevole (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Cloruro di zinco | Sigma-Aldrich |
Riferimenti
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods ....
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Ristampe e permessi
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