Presentato qui è un protocollo che combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale in vitro e l'incorporazione metabolica di sialoglycan con gruppi funzionali bioortogonali per espandere le cellule staminali primarie e progenitrici ed etichettare la loro superficie sialoglycoproteins per l'imaging o l'analisi della spettrometria di massa dei marcatori di superficie cellulare.
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Articolo metodologico
Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali neurali e progenitrici (NPG) sono la base cellulare per le strutture complesse e le funzioni del cervello. Si trovano in nicchie specializzate in vivo e possono essere isolati ed espansi in vitro,fungendo da risorsa importante per il trapianto di cellule per riparare i danni cerebrali. Tuttavia, gli NSPC sono eterogenei e non chiaramente definiti a livello molecolare o purificati a causa della mancanza di specifici marcatori di superficie cellulare. Il protocollo presentato, precedentemente riportato, combina un sistema di cocoltura neurale-endoteliale con un metodo di etichettatura glicana metabolica per identificare il sialoglycoproteooma superficiale dei NSPC primari. Il sistema di cocoltura nPC-endoteliale consente l'auto-rinnovamento e l'espansione dei NSPC primari in vitro,generando un numero sufficiente di NSPC. gruppi funzionali bioortogonali. Confrontando il sialoglybioteome da NPG auto-rinnovamento espanso in una co-coltura endoteliale con coltura neurale differenziante, identifichiamo un elenco di proteine di membrana che sono arricchite in NPC. Nel dettaglio, il protocollo prevede: 1) l'impostazione di una cocultura NSPC-endoteliale e la cultura differenziante NSPC; 2) etichettatura con azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); e 3) coniugazione di biotina a sialoglycan modificato per l'imaging dopo la fissazione della coltura neurale o l'estrazione di proteine dalla coltura neurale per l'analisi della spettrometria di massa. Quindi, i candidati marcatori di superficie arricchiti nsPC vengono selezionati mediante analisi comparativa dei dati della spettrometria di massa provenienti sia dal NSPC espanso che dalle colture neurali differenziate. Questo protocollo è altamente sensibile per identificare le proteine della membrana di scarsa abbondanza nei materiali di partenza e può essere applicato alla scoperta di marcatori in altri sistemi con modifiche appropriate
Introduzione
Le cellule staminali neurali sono definite come una popolazione cellulare multipotente che può auto-rinnovarsi per mantenere una piscina di cellule staminali e differenziarsi in neuroni e glia. Sono i principali tipi di cellule nel sistema nervoso e possono offrire un grande potenziale terapeutico nella medicina rigenerativa attraverso il trapianto di cellule in cervelli malati e feriti1,2. Come lo sviluppo procede, la popolazione di cellule staminali neurali diventa eterogenea3,4, e la proporzione di cellule staminali neurali nel cervello diminuisce g....
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Protocollo
Tutti i protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dall'IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università di Tsinghua ed eseguiti in conformità con le linee guida dell'IACUC. La struttura animale di laboratorio presso l'Università di Tsinghua è stata accreditata dall'AAALAC (Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratory Animal Care International). Per la messa in scena degli embrioni, la metà del giorno del tappo vaginale identificato è stata calcolata come giorno embrionale 0,5 (E0.5).
NOT: Tutte le cellule sono coltivate nell'incubatrice cellulare in condizioni ....
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Risultati
L'intera procedura per l'espansione in vitro e l'etichettatura metabolica degli NSPN embrionali primari richiede 6 giorni(Figura 1A). La qualità della linea cellulare BEND3 e degli NSPC primari appena isolati sono la chiave per un esperimento di successo. Le cellule BEND3 sono la fonte di fattori solubili che stimolano l'auto-rinnovamento e la proliferazione degli NSPC. Va assicurato che le cellule BEND3 siano prive di qualsiasi contaminazione e si dividano a.......
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Discussione
I marcatori di superficie sono comunemente utilizzati per etichettare e purificare specifici tipi di cellule in vitro e in vivo17,18. La scoperta dei marcatori di superficie contribuisce notevolmente alla medicina rigenerativa e alle ricerche sulle cellule staminali fornendo strumenti molecolari per arricchire selettivamente una popolazione di cellule staminali da tessuti e piatti di coltura normali o patologici, offrendo una cellula purificata per uso clinico o .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da divulgare.
Ringraziamenti
Le figure 1B, 1C, 1E e 1F sono riprodotte da Bai et al . 10 del sistema con il permesso della Royal Society of Chemistry. Ringraziamo Yi Hao nel laboratorio di X. C. per l'editing di figure. Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (da no. 91753206 a Q. S. e X. C., dal n. 31371093 al Q. S., e dal n. 21425204 e da 21672013 a X. C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutammina | Gibco | 25030081 | 1% |
| di piruvato di sodio | Sigma | P5280 | 1% |
| di N2 integratore | Gibco | 17502048 | 1 a 100 |
| N-acetil-L-cisteina | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papaina | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| integratore di B27 | Gibco | 17504044 | 1 a 50 |
| Poli-L-lisina | Sigma | P4707 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti di base | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | 1% |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco 14190094 | ||
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127 | 4% |
| Saccarosio | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| tampone RIPA | Thermo Scientific | 89900 | |
| tampone di caricamento SDS-PAGE 2x | Solarbio | P1018 | |
| piastra a 6 pozzetti | Corning | 3335 | |
| Gel proteico tris-glicina | invitrogen | xp00100box | |
| Monoclonale di topo anti-nestina | Studio sullo sviluppo Hybridoma Bank | Rat-401 | da 1 a 20 |
| Monoclonale di topo anti-beta-tubulina III | Sigma | T8860 | da 1 a 1.000 |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG1 | invitrogen | A-21121 | da 1 a 1.000 |
| Alexa Fluor 546 capra anti-topo IgG2b | invitrogen | A-21143 | da 1 a 1.000 |
| Albumina Bovina V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA kit di test | Thermo Scientific | 23225 | |
| Dimetil solfossido Sigma | D2650 | ||
| Brij97 | Aladino | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| Alchino-biotina | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Fare clic sugli strumenti chimici | 1084 | 100 µ M |
| 9AzSia | sintetizzato in laboratorio | ||
| Ascorbato di sodio | Sigma | A4034 | |
| Metanolo | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Farina 647-streptavidina | coniugatainvitrogen | S21374 | 1 a 1.000 |
| Trietanolammina | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidina | invitrogen | 60210 | |
| bicarbonato di ammonio | Sigma | 9830 | |
| Coomassie blu brillante R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| isoflurano | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNasi I | Sigma | DN25 | 12 µ g/mL |
| di Urea | Sigma | U5378 |
Riferimenti
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S.
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Ristampe e permessi
