Ett detaljerat protokoll för rening och efterföljande analys av en monoklonal antikropp från skördad cell odlings vätska (HCCF) av automatiserade mikrobioreaktorer har beskrivits. Användning av analys för att fastställa kritiska kvalitetsattribut (CQAs) och maximera begränsad provvolym för att extrahera viktig information presenteras också.
Monoklonala antikroppar (mAbs) är en av de mest populära och väl kännetecknas biologiska produkter som tillverkas idag. Vanligast produceras med kinesisk hamster äggstockar (CHO) celler, kultur och processförhållanden måste optimeras för att maximera antikropp titrar och uppnå mål kvalitets profiler. Normalt använder denna optimering automatiserade mikroanalys bioreaktorer (15 ml) för att avskärma flera processförhållanden parallellt. Optimerings kriterier inkluderar kultur prestanda och de kritiska kvalitetsattributen (CQAs) för den monoklonala antikroppen (mAb), som kan påverka dess effekt och säkerhet. Kultur prestandamått inkluderar celltillväxt och näringsämnes konsumtion, medan CQAs inkluderar mAb: s N-glykosylering och aggregering profiler, Charge-varianter, och molekylvikt. Detta detaljerade protokoll beskriver hur man renar och därefter analyserar HCCF-prover som produceras av ett automatiserat mikrobioreaktor system för att få värdefulla prestandamått och resultat. För det första används ett automatiserat protein en snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) metod för att rena mAb från skördade cellkulturer prover. När koncentrerade, de glykananalys profilerna analyseras av masspektrometri med hjälp av en specifik plattform (se tabellen av material). Molekylvikter och agg regeringsprofiler bestäms med hjälp av storleks uteslutnings-kromatografi-multipel vinkel ljusspridning (SEC-mals), medan laddningsvarianter analyseras med hjälp av mikrochip kapillärzon elektrofores (mcze). Förutom de kultur prestandamått som fångas under bioreaktor processen (dvs. kultur lönsamhet, cellantal och vanliga metaboliter, inklusive glutamin, glukos, laktat och ammoniak), analyseras förbrukade medier för att identifiera begränsande näringsämnen för att förbättra utfodringsstrategier och övergripande process design. Därför beskrivs också ett detaljerat protokoll för absolut kvantifiering av aminosyror med vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) av förbrukade medier. De metoder som används i detta protokoll utnyttjar plattformar med hög kapacitet som är kompatibla för ett stort antal små volym exempel.
Protein Therapeutics används för att behandla en växande variation av medicinska tillstånd inklusive vävnadstransplantation komplikationer, autoimmuna sjukdomar, och cancer1. Sedan 2004, Förenta staternas Food and Drug Administration (USFDA) har dokumenterat en ökande andel av biologiska licensansökningar (BLAs) av alla godkännanden som regleras av Center for Drug utvärdering och forskning (CDER), med BLAs står för över 25% 2014 och 20152.
Med tanke på denna expanderande marknad, biofarmaceutiska tillverkare utmanas att snabbt leverera mer produkt med jämn kvalitet. Ansträngningar för att öka produktens avkastning har fokuserat på CHO cell Engineering och produktion linje screening, även om de mest betydande förbättringarna beror på framsteg inom media/feed strategi optimering och cellkultur miljökontroller1, 3 , 4 , 5 under tillverkningsprocessen.
Eftersom mAbs produceras i ett biologiskt system, det kan finnas inneboende protein variation. Antikropps sammansättningen kan ändras efter translationellt, såsom glykosylering eller påverkas av nedbrytning eller enzymatiska reaktioner. Dessa strukturella variationer kan framkalla farliga immunreaktioner eller Alter antikroppsbindning, vilket i sin tur kan minska eller eliminera den avsedda terapeutiska funktionen5. Således övervakas och kontrolleras kritiska kvalitetsattribut (CQAs) av monoklonala antikroppar-N-Glycan-profil, laddningsvariant-fördelning och procentandelen av antikroppar i monomerform-regelbundet som en del av en kvalitets design (QbD)-metod under tillverkningsprocesser1,6. I en reglerad produktionsmiljö måste terapeutiska proteiner uppfylla acceptanskriterier för att licensieras som en godkänd kommersiell drog produkt7. De metoder som presenteras häri skulle normalt vara en del av kvalitetskarakteriseringsprocessen för en antikropp7,8, och alla proteinforskare kommer att vara bekant med deras användning.
I tidigare arbete9har användning och drift av mikrobioreaktorer för hög genomströmning screening av cell odlingsförhållanden i uppströms bio bearbetning beskrivits. Den renade produkten som erhålls från de varierande medie förhållandena utsätts för N-Glycan-analys med LC-MS. Glykosyleringmönster av terapeutiska proteiner kan upptäckas och karakteriseras med LC-MS-tekniker10,11och förekomst av olika glykananalys arter har kopplats till Bioprocess parametrar såsom foder strategi, pH, och temperatur12. Effekten av de varierande medie förhållandena på produktens kvalitet, som anges med den procentuella andelen av det resulterande IgG i monomerform, utvärderas också med kromatografi med storleks uteslutning-multi-Angle ljusspridning (SEC-mals)13,14 , 15. laddningsvariant-profilen representerar ett antal ändringar16 som kan påverka en produkts funktion. Microcapillary Zone elektrofores (mcze) är en teknik som erbjuder en betydligt snabbare Analystid jämfört med traditionell katjonbytarkromatografi och kapillärisoelektrisk fokusering (CIEF) metoder som används för laddning variant analys17 ,18. Förbrukade bioreaktor medier analyserades för att spåra aminosyrekonsumtionen under proteinproduktionen eftersom det relaterar till förändringar i antikroppens identifierande attribut19,20,21,22 , 23.
Protein analys gör det möjligt för oss att identifiera kritiska processparametrar (CPPs) baserat på relationerna mellan process ingångar och förändringar i CQAs. Under processen för utveckling av Bioprocess visar identifiera och mäta CPPs fundamentalt processtyrning och säkerställer att produkten inte har förändrats, vilket är viktigt i starkt reglerade tillverkningsmiljöer. I detta papper, analytiska tekniker för att mäta några av de biokemiska egenskaperna hos det protein som är mest relevant för produkten CQAs (N-Glycan profil, laddningvarianter, och storlek homogenitet) presenteras.
HCCF innehåller skräp och stora partiklar som kan täppa till och förstöra dyr instrumentering, så kultur förtydligande behövs innan ytterligare nedströms bearbetning. Centrifugering är i allmänhet det första sättet att separera celler och andra olösliga partiklar från proteiner följt av filtrering. Denna filtrerade HCCF utsätts sedan för snabb Proteinvätskekromatografi (FPLC) för rening. Rening av HCCF från automatiserade mikrobioreaktorer för att få produkten är ett viktigt steg i nedströms bearbetning. Här används ett bänkmonterade FPLC-system med ett protein a-kolonn för att erhålla monoklonala antikroppar från hccf. Analys för uppströms processer kan ge värdefull insikt i cellens beteende och vägleda Bioprocess design, vilket hjälper till att få en konsekvent och tillförlitlig kvalitetsprodukt. Med Analytics kan vi också länka kritiska kvalitetsattribut (CQAs) till processer uppströms och nedströms. Här presenteras fyra analyser som vanligen används vid karakterisering av monoklonala antikroppar. Dessa tekniker är robusta, pålitliga och lätt att driftsättas för process-och produktanalys från en mängd olika uppströms källor som endast är delvis renade och kan fortfarande innehålla restnivåer av DNA och HCP.
Vid rengöring av prover för analys, måste en viktig balans uppnås mellan att skapa ett prov som är tillräckligt ren för analys samtidigt som variationen i bio reaktorn bibehålls. De två vanligaste föroreningarna som påverkar produkten är DNA och HCP, som kan kontrolleras genom att mäta förhållandet absorbans vid 260/280 nm och genom SDS-PAGE eller μCE-SDS. De analyser som presenteras här är inte känsliga för låga halter av DNA-innehåll. Produktens renhet är > 95% ren, bestämd enligt μCE-SDS.
Charge variant analys med ett microcapillary elektrofores system ger en hög genomströmning metod för att identifiera laddningsvarianter, med chips och reagens som är relativt lätt att genomföra. Arten av tekniken och kemin i märkningen reagens är både känsliga för hjälpämnen och andra primära aminer, vilket kräver en avsaltning steg för de flesta prov matriser. Från erfarenhet, låga nivåer av DNA sammigrera med fri-Dye från märkningen reaktionen och påverkar inte kvaliteten på resultaten. Medan variationen av grundläggande, huvudsaklig, och sura toppkvantifiering är typiskt < 1%, högre nivåer av DNA och andra föroreningar kan öka variationen av analysen. Det är oerhört viktigt att vara förenlig med proteinhalten och säkerställa en snabb användning av DMF efter avlägsnande från flaskan och blandas med färgämnet. Lysin och/eller histidin standarder rekommenderas som märkning kontroller. Med tiden och beroende på prov kvalitet, kan chips foul eller förlora beläggningen på mikrofluidics kanaler, vilket leder till större buller, närvaron av Ghost toppar, och större prov-till-prov variation. För att identifiera denna förekomst analyserades ämnen och en system lämplighet standard (dvs. NISTmAb) samtidigt med proverna med jämna mellanrum. När spånproblem uppstår kan spånorna tvättas med förvaringslösningen eller bytas ut.
De metoder som används för glykananalys analys av terapeutiska glykoproteiner främst innebär vätskekromatografi (LC) och/eller masspektrometri (MS), med lektin Microarray analys ökar i popularitet som ett tredje alternativ25. Den metod som beskrivs i detta dokument använder både LC och MS, som har fördelar och nackdelar. Masspektrometriska metoder har fördelen av massverifiering av de analyserade glykanerna, vilket inte är möjligt med LC-baserade metoder som använder en fluorescerande detektions utgång eller lektin Microarrays. Den här metoden använder LC och fluorescensdetektion för att tilldela glykananalys identiteter med hjälp av retentionstid jämförelse med en dextran stege standard. Fluorescens-övervakning möjliggör ökad känslighet och kvantifiering på grund av enkelheten i dess detektion, där MS Alone kanske inte kan kvantifiera låg förekomst arter på grund av den dåliga joniseringseffektiviteten hos oligosackarider. Mass informationen från MS används för att bekräfta glykananalys-identiteter, men bearbetnings programmet använder inte massinformation som primära tilldelningskriterier. Därför, utan reproducerbar kromatografi och lätt matchas toppar, denna metod kan lida om glykananalys uppdrag. Lyckligtvis kan massan information hjälpa till med glykananalys uppdrag även i situationer när kromatografi är subpar, såsom Skift i retentionstiden som hindrar reproducerbara glykananalys tilldelningar. Om denna metod används utan MS, skall kromatografin vara på den högsta nivån eftersom massinformation inte kan användas för att korrigera uppehålls tids drift.
Aminosyran analysmetod som beskrivs här använder LC-MS för snabb kvantifiering av underivatiserade aminosyror i rå cellkultur media. Alternativa aminosyra analysmetoder kräver aminosyran derivatisering agenter för att möjliggöra UV-detektion26. LC-MS-metoden ger viktiga fördelar jämfört med LC-UV-metoden: den möjliggör identifiering baserad på både retentionstid och Jon massa i motsats till LC-UV-metoden, som begränsas av en brist på Mass karakterisering. Dessutom, LC-MS-metoden erbjuder tid och reproducerbarhet fördelar, eftersom LC-UV-metoden kräver en tidskrävande derivatisering reaktion, som kan ge prov variation27. Emellertid, injektion av rå cellkultur media i LC-MS-metoden kan orsaka skadliga effekter på MS signal på grund av Jon skimmer nedsmutsning. En kalibrerings stege injiceras ofta som en system lämplighet kontroll, och prov beställning är slumpmässigt för att förhindra bias i data.
Cellodlingsprocessen för produktion av antikroppar med hjälp av mikrobioreaktorer beskrivs tidigare9. I denna studie är detaljerade protokoll för metoder för att karakterisera monoklonala antikroppar som maximerar data som erhållits från begränsade provvolymer väldefinierade. Begränsade mängder av skördad cellkultur vätska kan ibland begränsa den förvärvade produktinformationen och urvalet av rätt analytiska förfaranden för att få Produktkvalitets data är viktigt. Analys är viktigt att länka samman uppströms processparametrar till förändringar i produktkvalitet. Här finns en riktlinje för användare att karakterisera mAbs när man arbetar med mikrobioreaktorer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka Scott LUTE för det analytiska stöd han tillhandahöll. Partiell intern finansiering och stöd för detta arbete tillhandahålls av CDER Critical Path-programmet (CA #1-13). Detta projekt stöds delvis av en utnämning till praktik/forskning deltagande program på kontoret för bioteknikprodukter, US Food and Drug Administration, administreras av Oak Ridge Institute for Science and Education genom en institutionsöverskridande avtal mellan USA: s energidepartement och FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |