Cellule di Merkel Polyomavirus infezione e rilevamento

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per infettare primario fibroblasti cutanei umani con MCPyV. Il protocollo include isolamento dei fibroblasti cutanei, preparazione di virioni di MCPyV, l'infezione del virus, colorazione di immunofluorescenza e fluorescenza l'ibridazione in situ. Questo protocollo può essere esteso per la caratterizzazione di interazioni MCPyV-ospite e scoprire altri tipi di cellule infettabili da MCPyV.

Abstract

Merkel cella polyomavirus (MCPyV) infezione può portare a carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), una forma altamente aggressiva di cancro della pelle. Gli studi meccanicistici completamente studiare biologia molecolare MCPyV e meccanismi oncogenici sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli della coltura cellulare adeguata. Qui, descriviamo una serie di protocolli per l'esecuzione e la rilevazione dell'infezione di MCPyV delle cellule epiteliali umane primarie. I protocolli descrivono l'isolamento dei fibroblasti cutanei umani, preparazione dei virions MCPyV ricombinante e la rilevazione dell'infezione del virus di colorazione di immunofluorescenza (IF) e reazione a catena del DNA-ibridazione in situ (HCR), che è un altamente sensibile fluorescenza in situ approccio di ibridazione (pesce). I protocolli di questo documento possono essere adattati dai ricercatori interessati per identificare altri tipi di cellule o linee cellulari che supportano MCPyV infezione. L'approccio descritto di pesce può anche essere adattato per rilevare i bassi livelli di DNA virale presente nella pelle umana infetta.

Introduction

Polyomavirus delle cellule di Merkel (MCPyV) è un piccolo, double-stranded virus a DNA che è stato associato con un tumore di pelle raro ma aggressivo, Merkel cell carcinoma (MCC)^1,2. Il tasso di mortalità di MCC, circa il 33%, superiore a quella del melanoma^3,4. MCPyV ha un genoma circolare di ~ 5 kb^1,5 , diviso in due da una regione regolatrice non codificanti (NCRR) in precoce e tardiva codifica regioni¹. Il NCRR contiene l'origine virale della replica (Ori) e promoto....

Protocol

Prepuzi neonatale umane sono stati ottenuti da Penn pelle malattia Research Center. Fibroblasti umani adulti sono stati ottenuti da pelle normale scartata dopo la chirurgia. Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Università della Pennsylvania Institutional Review Board.

1. isolamento dei fibroblasti cutanei umani

1. Utilizzare un paio di forbici per tagliare il grasso e del tessuto sottocutaneo dal prepuzio umano neonatale e tagliare il campione di pelle in metà o in quarti.
2. Incubare il tessuto in 5 mL di dispase 10mg/mL II in PBS completati con antibiotico antimicotico a 4 ° C durante la notte.
3. In un piatto....

Results

Il protocollo descritto in questo manoscritto ha permesso l'isolamento di una popolazione quasi omogenea di HDFs (Figura 1). Come dimostrato dalla macchiatura immunofluorescente, quasi il 100% di cellule cutanee umane isolate utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo sono state positivamente macchiato per gli indicatori dei fibroblasti cutanei, il vimentin e collagene sono²⁴, ma la negazione per l'essere umano marcatore .......

Discussion

I metodi descritti sopra, compreso isolamento dei fibroblasti cutanei dal tessuto di pelle umana, la preparazione dei virions MCPyV ricombinante, infezione di cellule coltivate, macchiatura immunofluorescente e un metodo sensibile di pesce adattato dalla tecnologia HCR, che dovrebbe consentire ai ricercatori di analizzare MCPyV infezione²⁷. Una delle fasi più critiche al raggiungimento MCPyV infezione in vitro è la produzione di preparazioni di alto-titolo virione. Utilizzando il protocollo per la.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siero fetale di vitello	HyClone	SH30071.03
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X	Thermo Fisher Scientific	11140050
GLUTAMAX I, 100X	Thermo Fisher Scientific	35050061	L-Glutammina
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Thermo Fisher Scientific	14190136
0,05% Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300-054
DMEM/F12 medio	Thermo Fisher Scientific	11330-032
Proteina EGF umana ricombinante, CF	R& D systems	236-EG-200	Conservare a -80 gradi Celsius
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	Conservare a -80 gradi Celsius
CHIR99021	Sigma	SML1046	Conservare a -80 gradi Celsius
Collagenasi di tipo IV	Thermo Fisher Scientific	17104019
Dispase II	Roche	4942078001
Antibiotic-Antimicotico	Thermo Fisher Scientific	15240-062	Protegge dalla luce
DMEM medium	Thermo Fisher Scientific	11965084
Alexa Fluor 594 capra anti-topo	IgG Thermo Fisher Scientific	A11032	Protegge dalla luce
Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG	Thermo Fisher Scientific	A11034	Protegge dalla luce
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma	D1556	Proteggere dalla luce
Paraformaldeide	Sigma	P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	sc-136172	Lotto # B2717
MCV VP1 coniglio		Siero policlonale di coniglio #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin	Roche	10843555001
Fattori di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), ricombinante umano	Corning	354060	Conservare a -80 gradi Celsius
Benzonasi Nucleasi	Sigma	E8263
DNasi ATP-dipendente sicura per il plasmide	EPICENTRE	E3101K
Tampone di ibridazione della sonda	Tecnologie
Tampone di lavaggio della sonda	Tecnologie		molecolari
Tampone di amplificazione			molecolari
Forcine marcate con Alexa 594	Tecnologie molecolari	B4	Protegge dalla luce
Triton X-100	Sigma	X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagente	Thermo Fisher Scientific	P7581
BamHI-HF	NEB	R3136
Tampone PB	Qiagen	19066
colonna di centrifuga miniprep blu	Qiagen	27104
Provette da centrifuga coniche da 50 ml	Corning	352070
T4 ligasi	NEB	M0202T
MagicMark XP	Thermo Fisher Scientific	LC5602