Discrimination des sept sous-ensembles de cellules immunitaires par deux-fluorochrome cytométrie en flux
Summary
Nous présentons ici un protocole de cytométrie en flux pour identifier les CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et monocytes dans le sang périphérique humain en utilisant seulement deux fluorochromes au lieu de sept. Avec cette approche, cinq marqueurs additionnels peuvent être enregistrées sur la plupart des cytomètres.
Abstract
Caractérisation de cellules immunitaires dépend fortement de cytométrie multicolore pour identifier les sous-populations basées sur l’expression différentielle des marqueurs de surface. Mise en place d’un panneau multicolor classique nécessite des instruments haut de gamme, personnalisés anticorps étiquetés et conception étude attentive à minimiser le chevauchement spectrale. Nous avons développé une analyse multiparamétrique afin d’identifier les principales populations immunitaires humaines (CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes) dans le sang périphérique en combinant sept marqueurs de la lignée à l’aide de seulement deux fluorochromes. Notre stratégie est basée sur l’observation que les marqueurs de la lignée expriment constamment dans une combinaison unique de chaque population de cellules. Combiner cette information avec une attention titrage des anticorps permet aux enquêteurs d’enregistrer cinq marqueurs additionnels, élargissant la limite optique de la plupart des cytomètres. Comparaison entre a démontré que la grande majorité des populations de cellules immunitaires dans le sang périphérique peut être caractérisée avec une précision comparable entre notre méthode et l’approche « un fluorochrome-un marqueur » classique, même si ce dernier est toujours plus précis pour l’identification des populations, comme les cellules NKT et cellules de T de γδ. Combinant sept marqueurs à l’aide de deux fluorochromes permet l’analyse de populations de cellules immunitaires complexes et des échantillons cliniques abordables 6-10 fluorochrome cytomètres de flux et même instruments de champ fluorochrome 2-3 dans les zones disposant de ressources limitées. Instruments haut de gamme peuvent également bénéficier de cette approche à l’aide de fluorochromes supplémentaires pour accomplir plus profonde analyse en cytométrie en flux. Cette approche convient également très bien pour le dépistage de plusieurs populations de cellules dans le cas des échantillons cliniques avec un nombre limité de cellules.
Introduction
Cytométrie en flux est une technique qui a été développée pour analyser des paramètres multiples sur des particules unique à un taux de plusieurs milliers d’événements par seconde1. Exemples d’échantillons analysés par cytométrie incluent, mais ne se limitent pas aux cellules, des perles, des bactéries, des vésicules et des chromosomes. Un système fluidique dirige des particules sur le point d’interrogation où chaque particule croise son chemin avec un ou plusieurs lasers, et plusieurs paramètres sont enregistrés pour une analyse ultérieure. Se disperse vers l’avant et latéraux, générée par la diffusion de la lumière laser pure, servent à identifier la population cible et récupérer des informations sur la taille relative et de la complexité interne/granularité des particules, respectivement. Tous les autres paramètres, qui représentent la majeure partie des données dans une analyse en cytométrie en flux, sont dérivés de sondes marquées fluorochrome qui reconnaissent et se lient à des cibles spécifiques sur les particules d’intérêt.
Cytométrie en flux est un outil de base pour les études immunologiques identifier et caractériser des populations cellulaires. Pour disséquer la complexité du système immunitaire, panneaux multicolores évoluent constamment pour augmenter le nombre de marqueurs enregistré simultanément pour profonde immunophénotypage des cellules des populations1. C’est menant à l’élaboration d’instruments plus performants et de fluorochromes, avec la récente haut de gamme cytomètres excédant 20 paramètres fluorescents. Cela se traduit dans la conception de l’étude complexe en raison du chevauchement spectrale fluorochrome et des coûts plus élevés associés aux opérateurs qualifiés étiquetage personnalisé anticorps. Dans plusieurs cas, la complexité et les coûts sont réduits en utilisant des panneaux séparés des marqueurs pour différentes populations cellulaires. Cette approche, cependant, est source d’erreurs, réduit l’information contenue dans chaque panneau et peut être difficile à appliquer aux échantillons avec un nombre limité de cellules. En outre, augmentant le nombre de marqueurs s’oppose immunophénotypage profonde sur les instruments avec moins de paramètres fluorescents. Nous avons développé précédemment un protocole de coloration afin d’identifier les principales populations immunitaires humaines (CD4+ et CD8+ T cellules, cellules γδ T, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes) en cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) en combinant sept marqueurs de la lignée à l’aide seulement deux fluorochromes au lieu de sept désiré avec le traditionnel « un fluorochrome-un marqueur » approche (www.hcdm.org)2,3. Notre rapport initial exploré et validé l’idée de combiner sept marqueurs dans deux fluorochromes pour immunophenotyping profonde. Dans ce rapport, nous présentons un protocole étape par étape pour isoler et en détachant les cellules du sang périphérique, mettant l’accent sur l’aspect pratique et de dépannage pour obtenir une coloration réussie.
Ce protocole est basé sur l’observation que les marqueurs de la lignée ont une expression constante sur la surface de la cellule et que la population de chaque cellule a une combinaison exclusive de marqueurs de la lignée. Dans les PBMC, CD3 expression subdivise les cellules immunitaires en deux grandes catégories : les lymphocytes T CD3 positifs et cellules CD3 négatives. Dans le sous-groupe positif CD3, CD4+, CD8+ et cellules de T de γδ peuvent être séparés en utilisant des anticorps qui ciblent uniquement des CD4, CD8 et le récepteur γδ. De façon comparable, au sein du sous-groupe négatif CD3, lymphocytes B, les cellules NK et les monocytes peuvent être identifiés de manière unique à l’aide d’anticorps anti-CD19, CD56 et CD14, respectivement. Dans une approche de fluorochrome-un marqueur un standard, anti-CD3-CD4,-CD8, – CD14,-CD19, CD56 et TCR – γδ anticorps sont détectés avec sept fluorochromes différents. Notre approche combine anti-CD3, – TCR – γδ anticorps à un fluorochrome (étiqueté pour fluorochrome commodité A) et anti-CD4 et CD56-CD8, – CD14 et – CD19 anticorps dans un fluorochrome différent (fluorochrome B). Ceci est possible par une combinaison d’un titrage d’anticorps et d’expression de l’antigène différentielle. Les deux CD4+ et CD8+ T cellules sont positifs pour les anticorps anti-CD3 au fluorochrome A, mais ils peuvent être séparés au fluorochrome B maximisant l’expression du signal CD8 tout en plaçant, avec un titrage ad hoc, le signal de CD4 entre le CD8 et les cellules de positif-CD4/CD8 double négation CD3. Les lymphocytes T γδ exprime plus élevé du CD3 que CD4 et CD8, et donc qu’ils soient reconnaissables comme CD3 haut4. Ce signal est plus accentuée d’étiquetage γδ NKT au fluorochrome A avec un anticorps anti-TCR γδ afin d’améliorer la séparation entre les cellules de T faibles CD3 et cellules γδ haute T CD3. Les cellules de B peuvent être identifiés comme CD3– A de fluorochrome et CD19+ au fluorochrome B. Pour séparer le CD3 les cellules NK négatives des cellules B, un anticorps anti-CD56 servait au fluorochrome A l’anti-CD3. Ceci est possible car le CD56 exprimé sur les cellules NK à un niveau beaucoup plus faible que le CD3 de cellules T5. Enfin, les monocytes peuvent être identifiés par une combinaison de propriétés de diffusion vers l’avant-latérale et l’expression de CD14 au fluorochrome B.
L’idée de combiner jusqu’à quatre marqueurs à l’aide de deux fluorochromes a été tentée avec succès avant6,7,8et a été utilisée dans un protocole clinique afin d’identifier les populations lymphoïde malignes9 . Un précédent rapport combiné également sept marqueurs (avec différente spécificité de marqueurs que nous avons utilisé dans notre protocole) en utilisant deux fluorochromes, mais cette approche s’est appuyé sur un étiquetage complexe de chaque anticorps avec une quantité variable de fluorochrome10. Ceci est en contraste avec notre méthode qui utilise des anticorps disponibles dans le commerce et peut être adapté à la configuration de l’instrument et peut tirer parti de la nouvelle génération des fluorochromes polymère.
L’objectif global de cette méthodologie est d’élargir les limites optiques de la plupart des cytomètres permettant l’enregistrement de cinq marqueurs additionnels pour interroger des populations cellulaires complexes. En conséquence, analyse immunologique avancée peut être réalisée sur 6-10 abordable fluorochrome cytomètres, et 2-3 instruments de champ fluorochrome peuvent atteindre des résultats remarquables dans les zones disposant de ressources limitées. Instruments haut de gamme peuvent également bénéficier de cette approche à l’aide de fluorochromes supplémentaires pour accomplir plus profonde analyse en cytométrie en flux et créer écoulement dénoyé panneaux par cytométrie en flux ciblant plusieurs lignages au même temps11. Cela peut potentiellement réduire le nombre de panneaux utilisés en cytométrie immunophénotypage modulaire et réduire les coûts, erreurs et le temps de manipulation. Cette approche convient également très bien dans le cas des échantillons cliniques avec un nombre limité de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici s’est avéré être très flexible et peu sensible aux changements de coloration de tampon, de température et de préparation de la cellule de sang périphérique en raison de la forte expression des marqueurs de la lignée sur la surface de la cellule. L’étape la plus critique pour l’obtention de données de haute qualité, reproductibles est un titrage d’anticorps. À noter, étant donné que le titrage des anticorps doit toujours être effectué lors de l’installation d’un pan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le National Institute of Arthritis et les troubles musculo-squelettiques et les maladies de la peau, , attribution numéro P30-AR053503 ; La Fondation Stabler, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy and Infectious Disease, www.niaid.nih.gov, T32AI007247 ; Nina Irlande programme pour la santé pulmonaire (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
Riferimenti
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