Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.
Abstract
Caracterización de células inmunitarias se basa pesadamente multicolor por citometría de flujo para identificar subpoblaciones basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie. Instalación de un panel multicolor clásico requiere instrumentos High-End, anticuerpos etiquetados personalizados y cuidadoso estudio diseño para minimizar la superposición espectral. Hemos desarrollado un análisis multiparamétrico para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en sangre periférica mediante la combinación de siete marcadores de linaje utilizando sólo dos fluorocromos. Nuestra estrategia se basa en la observación que los marcadores de linaje se expresan constantemente en una combinación única por cada población celular. Combinando esta información con una cuidadosa titulación de los anticuerpos permite a los investigadores grabar cinco marcadores adicionales, ampliando el límite óptico de la mayoría los citómetros de flujo. Comparación directa demostró que la gran mayoría de las poblaciones de células inmunitarias en la sangre periférica puede ser caracterizada con precisión comparable entre nuestro método y el “un marcador fluorocromo y un enfoque clásico”, aunque este último sigue siendo más precisos para la identificación de las poblaciones, como las células NKT y células de T del γδ. La combinación de siete marcadores con dos fluorocromos permite el análisis de poblaciones celulares inmunes complejos y muestras clínicas en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 e incluso en 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo. Este enfoque es también muy adecuado para la detección de varias poblaciones de la célula en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.
Introduction
Citometría de flujo es una técnica que fue desarrollada para analizar varios parámetros en solas partículas a una velocidad de varios miles de sucesos por segundo1. Ejemplos de muestras analizadas por citometría de flujo incluyen, pero no se limitan a, las células, los granos, bacterias, vesículas y cromosomas. Un sistema fluídico dirige las partículas en el punto de interrogación donde cada partícula cruza su camino con uno o más láseres, y varios parámetros son grabados para su posterior análisis. Scatter delantero y lateral, generado por la dispersión de la luz láser puro, se utiliza para identificar la población objetivo y recuperar información sobre el tamaño relativo y la complejidad interna/granularidad de las partículas, respectivamente. Todos los otros parámetros, que representan la mayor parte de los datos en un análisis de citometría de flujo, se derivan por sondas marcadas con el fluorocromo que reconocen y se unen a objetivos específicos en las partículas de interés.
Citometría de flujo es una herramienta primaria para estudios inmunológicos identificar y caracterizar poblaciones celulares. Para diseccionar la complejidad del sistema inmune, paneles multicoloras evolucionan constantemente para ampliar el número de marcadores simultáneamente grabada para profunda Inmunofenotipificación de poblaciones de células1. Esto conduce al desarrollo de los instrumentos más capaces y fluorocromos, con citómetros de flujo gama alta reciente superior a 20 parámetros fluorescentes. El resultado en el diseño de estudio complejo debido a la superposición espectral fluorocromo y en costes más altos asociados con encargo anticuerpo etiquetado y calificados operadores. En varios casos, complejidad y los costes se reducen mediante el uso de distintos paneles de marcadores de diferentes poblaciones celulares. Este enfoque, sin embargo, es propenso a errores, reduce la información en cada panel y puede ser difícil de aplicar a las muestras con número limitado de células. Por otra parte, aumentar el número de marcadores excluye immunophenotyping profunda en los instrumentos con menos parámetros fluorescentes. Previamente hemos desarrollado un protocolo de tinción para identificar las poblaciones inmunes humanas principales (CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos) en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la combinación de siete marcadores de linaje mediante sólo dos fluorocromos en lugar de los siete necesarios usando el tradicional “un marcador fluorocromo y un” enfoque (www.hcdm.org)2,3. Nuestro informe inicial había explorado y había validado la noción de combinar siete marcadores de dos fluorocromos de immunophenotyping profundo. En este informe, presentamos un protocolo paso a paso para aislar y la tinción de células sanguíneas periféricas, centrándose en el aspecto práctico y solución de problemas de pasos para lograr una acertada coloración.
Este protocolo se basa en la observación que marcadores de linaje tienen una expresión constante en la superficie celular y que cada población celular tiene una exclusiva combinación de marcadores de linaje. En PBMCs, expresión de CD3 subdivide las células inmunes en dos categorías principales: los linfocitos T CD3-positive y células CD3 negativas. Dentro del subgrupo positivo de CD3, CD4+, CD8+ y las células de T del γδ se pueden separar utilizando anticuerpos dirigidos exclusivamente a CD4, CD8 y el receptor γδ. De manera similar, dentro del subgrupo negativo CD3, las células B, células NK y monocitos pueden identificarse unívocamente usando los anticuerpos contra CD19, CD56 y CD14, respectivamente. En un enfoque de un fluorocromo marcador uno estándar, anti-CD3-CD4,-CD8, CD14,-CD19, CD56 y – TCR γδ los anticuerpos se detectan con siete diferentes fluorocromos. Nuestro enfoque combina anti-CD3, CD56 y – TCR γδ anticuerpos en un fluorocromo (designada para el fluorocromo de conveniencia A) y anti-CD4,-CD8, CD14 y – CD19 anticuerpos en un fluorocromo diferente (fluorocromo B). Esto es posible por una combinación de valoración de anticuerpos y antígeno diferencial expresión. Ambos CD4+ y CD8+ T las células son positivas para el anticuerpo anti-CD3 en fluorocromo A, pero se pueden separar en fluorocromo B maximizar la expresión de la señal de CD8 colocando con una titulación especial, la señal de CD4 entre el CD8 y las células de CD3 positivo-CD4/CD8 dobles negativas. Las células de T del γδ expresa mayor nivel de CD3, CD4 y CD8, y por lo tanto pueden ser identificados como CD3 alto4. Esta señal es impulsada más por etiquetado γδ células de T en fluorocromo A con un anti-TCR γδ los anticuerpos, mejorando la separación entre células T baja de CD3 y células Tγδ alta T de CD3. Las células de B pueden identificarse como CD3– en el fluorocromo A y CD19+ en fluorocromo B. Para separar las células NK negativo CD3 de células B, fue utilizado un anticuerpo anti-CD56 en fluorocromo A como anti-CD3. Esto es posible porque expresa CD56 de células NK en un nivel mucho más bajo que el CD3 en células T5. Finalmente, los monocitos pueden ser identificados mediante una combinación de propiedades de dispersión hacia delante-lateral y expresión de CD14 en fluorocromo B.
La idea de combinar hasta cuatro marcadores con dos fluorocromos se ha intentado con éxito antes de6,7,8y se ha utilizado en un protocolo clínico para identificar poblaciones linfocíticas malignas9 . Un informe anterior también combinado siete marcadores (con diferente especificidad de los marcadores que utilizamos en nuestro protocolo) usando dos fluorocromos, pero ello dependía de un complejo etiquetado de cada anticuerpo con diferente cantidad de fluorocromo10. Esto está en contraste con el método que utiliza anticuerpos comercialmente disponibles y puede ser adaptado a la configuración del equipo y puede tomar ventaja de la nueva generación de fluorocromos de polímero.
El objetivo general de esta metodología es ampliar los límites ópticos de mayoría citómetros de flujo, permitiendo la grabación de cinco marcadores adicionales para interrogar a las poblaciones de la célula compleja. Como consecuencia, análisis inmunológicos avanzado pueden realizarse en citómetros de flujo fluorocromo asequible 6-10 y 2-3 instrumentos de campo de fluorocromo pueden lograr resultados notables en áreas con recursos limitados. Instrumentos de alta gama también pueden beneficiarse de este enfoque mediante el uso de fluorocromos extras para llevar a cabo análisis de citometría de flujo más profundo y crear flujo modular cytometric paneles dirigidos a varios linajes en el mismo tiempo11. Esto puede potencialmente reducir el número de paneles utilizados en citometría de flujo immunophenotyping modular y reducir los costos, errores y tiempo de manipulación. Este enfoque es también muy adecuado en el caso de muestras clínicas con un número limitado de células.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí se ha demostrado para ser bastante flexible e insensible a los cambios en la coloración de tampón, la temperatura y la preparación de células de sangre periférica debido a la alta expresión de marcadores de linaje en la superficie celular. El paso más crítico para obtener datos reproducibles y de alta calidad, es la titulación de anticuerpos. De la nota, ya que la titulación de anticuerpos debe realizarse siempre durante la instalación de un panel de citometría de flujo, este pas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel, , Premio número P30-AR053503; La Fundación más estable, www.stablerfoundation.org; Nacional Instituto de alergias y enfermedades infecciosas, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Programa de Irlanda de Nina para la salud pulmonar (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
Riferimenti
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