Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

Maria Letizia Giardino Torchia; Raffaello Cimbro

doi:10.3791/58955

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Articolo metodologico

Discriminazione dei sette sottoinsiemi delle cellule immuni di due-fluorocromo flusso Cytometry

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DOI:

10.3791/58955

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5 marzo 2019

Maria Letizia Giardino Torchia¹ , Raffaello Cimbro²

¹Oncology Research, Medimmune, LLC, ²Division of Rheumatology, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo di cytometric di flusso per identificare CD4⁺ e CD8⁺ T cellule, γδ T, cellule B, cellule NK e monociti nel sangue periferico umano utilizzando solo due fluorocromi anziché sette. Con questo approccio, cinque ulteriori marcatori possono essere registrati sulla maggior parte dei citometri a flusso.

Abstract

Caratterizzazione delle cellule immuni si basa fortemente su multicolor flusso cytometry per identificare sottopopolazioni basate su espressione differenziale dei marcatori di superficie. Installazione di un pannello multicolor classico richiede strumenti high-end, gli anticorpi con etichettati personalizzati e attento studio design per minimizzare la sovrapposizione spettrale. Abbiamo sviluppato un'analisi multiparametrica per identificare le principali popolazioni umane immuni (CD4⁺ e CD8⁺ T cellule, cellule T γδ, cellule B, cellule NK e dei monociti) nel sangue periferico mediante la combinazione di sette indicatori di lignaggio utilizzando solo due fluorocromi. La nostra strategia si basa sull'osservazione che marcatori lignaggio costantemente sono espressi in una combinazione unica di ogni popolazione cellulare. Combinando queste informazioni con un'attenta titolazione degli anticorpi permette ai ricercatori di registrare cinque indicatori aggiuntivi, espandendo il limite ottico della maggior parte dei citometri a flusso. Confronto testa a testa ha dimostrato che la stragrande maggioranza delle popolazioni di cellule immuni nel sangue periferico può essere caratterizzata con precisione paragonabile tra il nostro metodo ed il classico "approccio di indicatore di un fluorocromo-uno", anche se quest'ultimo è ancora più precisi per l'identificazione di popolazioni come T γδ cellule e cellule NKT. Combinazione di sette indicatori utilizzando due fluorocromi permette l'analisi delle popolazioni delle cellule immuni complesse e campioni clinici su citometri a flusso fluorocromo conveniente 6-10 e anche su 2-3 strumenti di campo fluorocromo nelle aree con risorse limitate. Strumenti high-end possono inoltre beneficiare di questo approccio utilizzando fluorocromi supplementari per compire più profonda analisi di citometria a flusso. Questo approccio è anche molto adatto per lo screening di diverse popolazioni di cellule nel caso di campioni clinici con numero limitato di cellule.

Introduzione

Citometria a flusso è una tecnica che è stata sviluppata per analizzare più parametri su singole particelle ad una velocità di diverse migliaia di eventi al secondo¹. Esempi di esemplari analizzati tramite flusso cytometry includono, ma non sono limitati a, cellule, perline, batteri, vescicole e cromosomi. Un sistema fluidico dirige le particelle nel punto di interrogatorio dove ogni particella si interseca il percorso con uno o più laser, e più parametri vengono registrati per ulteriori analisi. Disperde in avanti e laterali, generati dallo scattering della luce pura laser, vengono utilizzati per identificare la popolazione target e recuperare....