Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La leucina ricca di chinasi 2 (LRRK2) è il gene più frequentemente mutato nella malattia ereditaria del Parkinson (PD) e tutte le mutazioni patogene dell'LRRK2 provocano l'iperattivazione della sua funzione di chinasi. Qui, descriviamo un saggio facile e robusto per quantificare l'attività della via della chinasi LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici dell'uomo misurando la fosforolazione controllata da LRRK2 di uno dei suoi substrati fisiologici, Rab10 alla trenolina 73. L'analisi dell'immunoblotting descritta richiede un anticorpo completamente selettivo e fosfospecifico che riconosca l'epitopo Rab10 Thr73 fosforerilato da LRRK2, come l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10. Esso utilizza neutrofili del sangue periferici umani, perché il sangue periferico è facilmente accessibile e i neutrofili sono un costituente abbondante e omogeneo. È importante sottolineare che i neutrofili esprimono livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10. Un potenziale inconveniente dei neutrofili è la loro elevata attività intrinseca di proteasi serina, che richiede l'uso di inibitori della proteasi molto potenti come la diisopropylfluorofosfati (DIFP) organosa. Tuttavia, i neutrofili sono una risorsa preziosa per la ricerca sull'attività del percorso della chinasi LRRK2 in vivo e dovrebbero essere considerati per l'inclusione nelle collezioni di biorepository della PD.
Introduzione
I tentativi di rallentare o fermare il morbo di Parkinson (PD) sono finora falliti. La scoperta di mutazioni iperattive nella leucina ricca ripetizione chinasi 2 (LRRK2) che causano e/o aumentano il rischio di PD ha portato allo sviluppo di inibitori della chinasi LRRK21,2,3. Questi sono ora entrati negli studi clinici4. L'esatta funzione di LRRK2 non è chiara, ma un importante progresso è stata l'identificazione di un sottoinsieme di proteine Rab GTPase, tra cui Rab10, come il primo substrati fisiologici in buona fede della chinasi LRRK2
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Secondo la normativa locale del Regno Unito, tutte le manipolazioni e il pipettaggio del sangue umano sono intrapresi in un armadietto di sicurezza biologica di categoria 2. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il comitato di revisione etica locale e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.
1. Preparazione
- Preparare 0,1 mL di EDTA Stock Solution 1 contenente 100 mM EDTA in salina con buffer fosfato (PBS).
- Preparare 60 mL di EDTA Stock Solution 2 contenente 1 mM EDTA in PBS.
- Preparare il buffer di lisi contenente 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il nostro saggio permette di interrogare l'attivazione della chinasi LRRK2 associata alla PD nei neutrofili del sangue periferici umani con la fosforo laphorylazione Rab10 dipendente da LRRK2 come lettura. I neutrofili sono una popolazione omogenea e abbondante di globuli bianchi periferici che esprime alti livelli di proteine LRRK2 e Rab10 (Figura 1). L'unica altra popolazione cellulare tra le restanti cellule mononucleari del sangue periferiche (PBMC) con un alto numero di copie di entramb.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Compelling evidenze cliniche, genetiche e biochimiche indicano un ruolo importante per LRRK2 e in particolare la sua funzione di chinasi nella malattia di Parkinson7. Gli inibitori della chinasi LRRK2 sono stati sviluppati e stanno entrando negli studi clinici2,4,12. Come tale, è necessario sfruttare LRRK2 come biomarcatore per l'impegno con il bersaglio e per la stratificazione del paziente. Il nostro pr.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i volontari sani che hanno gentilmente donato sangue per il presente studio. Ringraziamo la Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) e la leadership dello studio Fox BioNet (FBN) per il loro sostegno e input verso il protocollo scritto e il video. Ringraziamo il professor Alexander simprich dell'Università di Vienna in Austria per aver testato il nostro protocollo e la nostra collaborazione. Apprezziamo i contributi di Paul Davies al progetto (direttore generale della PPU MRC). Riconosciamo anche l'eccellente supporto tecnico dei team MRC Protein Phosphorylation and Ubiquilation Unit (PPU), vale a dire Chemical Synthesis (Natalia Shpiro pe....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 mL Puntali per pipette | Sarstedt | 70.762 | o equivalente |
| 1,5 mL Microprovette | Sarstedt | 72.690.001 | o equivalente |
| 10 mL Puntali per pipette | Sarstedt | 86.1254.025 | o equivalente |
| 10 μ L Puntali per pipette | Sarstedt | 70.113 | o |
| equivalente 15 mL provetta falcon | Cellstar | 188 271 | o |
| equivalente 200 μ L Puntali per pipette | Sarstedt | 70.760.002 | o |
| equivalente 25 mL Puntali per pipette | Sarstedt | 86.1685.001 | o |
| equivalente provetta di falco da 50 mL | Cellstar | 227 261 | o equivalente |
| BD Vacutainer Hemogard Chiusura Plastica K2-EDTA Tubo | BD | BD 367525 | o |
| equivalente Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuga | Beckman | o equivalente con rotatore a secchiello da nuoto per provette falcon da 15 mL e 50 mL a velocità 1000-1200 x g | |
| Cabina di sicurezza biologica di categoria 2. | |||
| cocktail di inibitori della proteasi cOmplete (senza EDTA) | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (diisopropilfluorofosfato) | Sigma | D0879 | Preparare la soluzione madre 0,5M in isopropanolo utilizzando precauzioni speciali. |
| Dimetilsolfossido | Sigma | 6250 | |
| Ghiaccio secco o azoto | |||
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | ThermoFisher | 14190094 | o equivalente Magnete |
| Easy 50 EasySep | Stemcell | 18002 | per contenere 1 provetta conica da 50 ml |
| Kit di isolamento diretto dei neutrofili umani EasySep | Stemcell | 19666 | Questo contiene Soluzioni chiamate " Cocktail di isolamento" e " RapidSpheres perline magnetiche |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuga 5417R centrifuga | Eppendorf | ||
| Etanolo, in flacone | |||
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma | E6758 | |
| Ghiaccio | |||
| Isopropanolo (grado anidro) | Sigma | 278475 | |
| tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerofosfato, 5 mM pirofosfato di sodio, 0,27 M saccarosio, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanolo, 1x cocktail di inibitori della proteasi cOmplete (senza EDTA) (Roche), 1 μ g/ml di microcistina-LR, 0,5 mM di diisopropilfluorofosfato (DIFP). | in alternativa tampone di lisi congelato in aliquote senza Microcistina-LR, DIFP disponibile da MRC-PPU Reagenti (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inibitore II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | o equivalente (inibitore LRRK2 potente e selettivo) |
| Microcistina-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml in DMSO e conservare a -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot sistema di imaging | Odyssey | ||
| Pennarello | |||
| Dispositivi | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | o |
| pirofosfato di sodio | Sigma | S22 | |
| saccarosio | Sigma | S0389 | |
| β-glicerofosfato | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | M3148 | |
| Anticorpi consigliati per Western blotting | |||
| Anticorpo anti-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-&alfa;-tubulina | Cell Signaling Technologies | 5174 | utilizzato a diluizione 1:2000 |
| Anti-topo di capra IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | utilizzato a diluizione 1:10.000 |
| Anti-topo di capra IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | utilizzato a diluizione 1:10.000 |
| Capra anti-coniglio IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | utilizzato a diluizione 1:10.000 |
| MJFF-totale Rab10 anticorpo di topo | generato da nanoTools (nanotools.de) | non applicabile* | utilizzato a 2 μ g/ml di concentrazione finale; * L'anticorpo MJFF-total Rab10 generato da nanoTools (www.nanotools.de) [11] sarà commercializzato dalla Michael J Fox Foundation nel 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | usato a 1 μ g/ml di concentrazione finale |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagenti e servizi | UDD2 | utilizzato a 1 μ g/ml di concentrazione finale |
Riferimenti
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
