Isolering av embryonale vev og dannelse av vaktel-kylling Chimeric organer Thymus eksemplet
Summary
Denne artikkelen inneholder en metode for å isolere ren embryonale vev fra vaktel og kylling embryoer som kan kombineres til skjemaet ex vivo chimeric organer.
Abstract
Kapasitet til å isolere embryonale vev var et viktig skritt for å etablere vaktel-kylling chimera systemet, som i sin tur har gitt ubestridte bidrag til avsløring nøkkelprosesser i utviklingsbiologi.
Her er beskrevet en optimalisert metode for å isolere embryonale vev fra vaktel og kyllinger mikrokirurgi og enzymatiske fordøyelsen, mens bevare sin biologiske egenskaper. Etter isolasjon, vev fra begge arter er knyttet på en i vitro organotypic analysen for 48 h. vaktel og kylling vev kan bli diskriminert distinkte kjernefysiske egenskaper og molekylære markører slik at studiet av den cellulære kryss-snakk mellom heterospecific tilordning av vev. Denne tilnærmingen er derfor et nyttig verktøy for å studere komplekse vev interaksjoner i utviklingsprosesser med svært dynamiske romlige modifikasjoner, som de oppstår under pharyngeal morphogenesis og dannelsen av foregut endoderm-avledet organer. Denne eksperimentelle ble først utviklet for å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon. I dette, den endoderm-avledet potensielle thymic rudiment og mesoderm-avledet mesenchyme, ble isolert fra vaktel og kylling embryoer, henholdsvis.
Kapasiteten til de tilknyttete vev å generere organer kan videre testes av pode dem på chorioallantoic membran (CAM) av en kylling fosteret. CAM gir næringsstoffer og gir gass utvekslinger på explanted vev. Etter 10 dager i ovo utvikling, kan chimeric organer analyseres i høstet explants av konvensjonelle morfologiske metoder. Denne fremgangsmåten kan også studere vev-spesifikke bidrag under orgel formasjon, fra den første utviklingen (i vitro utvikling) til sluttfasen av organogenesen (i ovo utvikling).
Til slutt forbedret isolasjon metoden også gir tredimensjonalt (3D) bevart embryonale vev, som også kan brukes for høy oppløsning topografiske analyse av vev-spesifikke genuttrykk mønstre.
Introduction
I 1970, ble en elegant vaktel-kylling-chimera-systemet utviklet av Le Douarin, åpner nye muligheter for å forstå rollen av celle migrasjon og mobilnettet interaksjoner under utvikling1,2. Modellen ble utviklet på premisset om at cellen utveksling mellom de to artene ikke ville betydelig forstyrre embryogenesis, senere bekreftet når studere mange utviklingsprosesser, inkludert dannelsen av nervøse og den blodkreft systemer1. Tar sistnevnte som et eksempel, syklisk bølger blodkreft progenitors kolonisere thymic epithelial rudiment ble først observert med vaktel-kylling chimera systemet3. For at var potensielle territorium thymus, endoderm av tredje og fjerde pharyngeal poser (3/4PP), mekanisk og enzymatisk isolert fra vaktel (q) embryo på 15 til 30 – somite scenen [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Disse fasene tilsvarer kylling Hamburger og Hamilton4 (HH) – stadier 12-17. Isolering prosedyrer startet med bruk av trypsin å enzymatisk dissociate endoderm fra den tilknyttede mesenchyme. Den isolerte endoderm ble podet inn i somatopleura regionen en vert kylling (c) embryo på E3-E3.5 (HH-stadier 20-21). Denne heterologous mesenchyme ble ansett som “ettergivende” thymic epitel utvikling bidrar også til orgel formasjon3. Etter infiltrert påfølgende bølger av kylling vert blodbårne progenitor celler vaktel donor thymic epitel motparten bidrar thymus formasjonen i vert embryoet3.
Nylig en modifisert versjon av denne tilnærmingen ble også vist seg for å være viktig for å studere epithelial-mesenchymal interaksjoner i tidlige stadier av thymus formasjon5. I denne forbindelse ble vev involvert i dannelsen av ektopisk thymus i chimeric embryo3 isolert, både fra giver og vert embryoer, og tilhørende ex vivo. En forbedret protokollen ble brukt til å isolere vaktel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) og kylling somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale vev ble isolert av mikrokirurgi med i vitro pancreatin fordøyelsen. Også var betingelsene for enzymatisk fordøyelsen, temperatur og tid med inkubering optimalisert vev-type og utviklingsstadiet (tabell 1).
Deretter ble isolert vev assosiert i en organotypic i vitro system for 48t, som tidligere rapportert5,6. I vitro foreningen av vev etterligner de lokale mobilnettet interaksjonene i embryo, overvinne noen begrensninger av i vivo manipulering. Dette systemet er spesielt nyttig å studere mobilnettet interaksjoner i komplekse morphogenic hendelser, for eksempel utvikling av pharyngeal apparatet.
Bidraget fra hver vev i thymus histogenesis og til heterospecific Association til å generere en thymus kan videre utforsket bruke CAM metodikk, tidligere detaljert5,7,8. Konsist, var kulturperler vev podet på CAM av cE8 embryo og bygge i ovo 10 dager. Deretter ble thymus formasjon evaluert av morfologisk analyse i høstet explants. Som de vaktel-kylling Realencyclopädie3, ble vaktel thymic epitel kolonisert av blodkreft stamfar celler (HPCs) fra kylling embryoet, som ble vist å bidra til orgel utvikling9,10 . HPCs overført fra embryoet til ektopisk chimeric thymus gjennom svært vascularized CAM5,7,8. Vaktel avledede thymic epitel kan identifiseres av immunhistokjemi ved hjelp av artsspesifikke antistoffer (dvs. QCPN – MAb vaktel PeriNuclear), overvinne behov for vev-spesifikke molekylære markører.
Denne eksperimentell metode, lar som i two-step rapportert i forrige publikasjonen8, modulering av signal av vanlige administrasjonen av farmakologiske agenter i vitro og ovo utvikling. Explants kan også høstes på noe tidspunkt i løpet av eksperimentet8.
Til slutt, isolasjon protokollen her detaljert tillater bevaring av de naturlige egenskapene og 3D-arkitektur embryonale vev, spesielt nyttig for detaljering i situ genuttrykk mønstre av embryonale territorier ellers utilgjengelig som konvensjonelle metoder. I tillegg kan transcriptome analyse tilnærminger, inkludert RNA-seq eller microarrays, også brukes i isolerte vev uten genetiske markører samtidig som en vev-spesifikke høy gjennomstrømning “omics” analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embryonale vev isolasjon prosedyren finnesher ble forbedret fra tidligere metoder for å produsere vaktel-kylling chimeric embryoer i ulike biologiske sammenhenger3,5,6.
Denne tilnærmingen er egnet til å isolere ren embryonale vev uten at genetisk manipulasjon eller bruk av vev-spesifikke markører, som ofte ikke fastslått, begrense bruk av genmodifiserte dyr modeller. Det kan brukes å studere epi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlig til Isabel Alcobia for kritisk lesing av manuskriptet, Mário Henriques for video lydkommentarer og Vitor Proa fra tjenesten Histology Instituto de Histologia e Biologia gjøre Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, kundestøtte. Vi er spesielt gjeld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (audiovisuelle enhet), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres enestående engasjement for produksjon av denne videoen. Vi erkjenner Leica Microsystems for vennlig å gi en stereoscope utstyrt med en system og Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, sa for å bidra med vaktelegg befruktede egg. Dette arbeidet ble støttet av Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
Riferimenti
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Biologia dello sviluppo. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Biologia dello sviluppo. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Biologia dello sviluppo. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
