Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay
Summary
Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.
Abstract
Kloof kruispunten (GJs) zijn celmembraan kanalen waarmee verspreiding van moleculen kleiner dan 1 kDa tussen aangrenzende cellen. Als er fysiologische en pathologische rollen, moet er van high-throughput screening (HTS) tests om te identificeren GJ modulatoren in drug discovery en toxicologie testen. Een roman jodide-geel fluorescerende eiwit-gap junction-intercellulaire communicatie (I-YFP-GJIC) assay vervult deze behoefte. Het is een cel-gebaseerde test met inbegrip van de donor en acceptor cellen die zijn ontworpen om te stabiel express een gele fluorescerende eiwit (YFP)-variant, waarvan fluorescentie gevoelig door jodide, of SLC26A4, een transporter jodide, respectievelijk uitgeblust is. Wanneer jodide wordt toegevoegd aan een gemengde cultuur van de twee celtypes, zij voert de donor cellen via de SLC26A4 transporter en diffuus aan de cellen van de aangrenzende acceptor via GJs waar ze de YFP fluorescentie doven. YFP fluorescentie is goed door goed gemeten in een kinetische modus. De YFP blussen tarief weerspiegelt GJ activiteit. De test is betrouwbaar en snel genoeg om te worden gebruikt voor de HTS. Het protocol voor de ik-YFP-GJIC-assay met behulp van de LN215 cellen, menselijke glioma cellen, wordt beschreven.
Introduction
Kloof kruispunten (GJs) fungeren als intercellulaire kanalen om de verspreiding van kleine moleculen van < 1 kDa zoals voedingsstoffen en metabolieten signalering moleculen tussen aangrenzende cellen. De regulates elementen bevatten een hemichannel of connexon in elke cel en elke connexon vormt zes connexins (Cxs)1. GJs en Cxs zijn gebruikt in de toxicologie testen van kankerverwekkende stoffen zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK’s), die GJ remmers,2,,3,4 zijn. Verstoorde GJIC is geassocieerd met nongenotoxic carcinogenese5,6. Als een potentiële therapeutisch doel, heeft in bijzonder subtypen van vangsten7,8, bescherming tegen hart- en hersenen ischemie/reperfusie letsel9, migraine met aura10GJ betrokkenheid gemeld drug-geïnduceerde lever schade6,11, en wond genezing van12. High-throughput screening (HTS) testen zijn vereist om GJ-modulerende chemicaliën of antilichamen voor drugontdekking, voor Toxicologie testen, te identificeren en te identificeren roman cellulaire regulatoren van GJ activiteit. HTS testen kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van structuur-activiteit verhoudingen van GJ modulatoren2,13,14,15.
Sommige GJIC tests omvatten dye overdracht of dual patch-clamp technieken. Lucifer gele CH (LY) en calceïne acetoxymethyl ester (calceïne-AM) zijn gebruikt in dye-overdracht testen. Cellen zijn niet luchtdoorlatend LY, die is ingevoerd door microinjection, schraap laden of electroporation. Eenmaal in de cel, LY verspreidt in naburige cellen via GJs en GJ activiteit wordt bepaald door de omvang van de LY migratie16. Calceïne-AM testen is meestal sprake van herstel van de kloof-fluorescentie na photobleaching17,18. Calceïne-AM is een cel-permeant kleurstof die door een intrinsieke nte esterase intracellulair wordt omgezet in ondoordringbare calceïne. De bepaling vereist een confocal microscoop te observeren van de overdracht van calceïne-AM in een cel van die eromheen na laser photobleaching. Als functionele GJs aanwezig zijn, calceïne-AM in aangrenzende cellen binnenkomt de photobleached cellen en de fluorescentie wordt teruggewonnen. GJ activiteit wordt bepaald door de mate van herstel van de fluorescentie van de photobleached cellen. Dye-overdracht testen zijn moeizaam en tijdrovend of lage gevoeligheden. Dual patch klemmen is een elektrofysiologische methode die regulates geleidbaarheid maatregelen. Het is relatief gevoelig, met een directe afhankelijkheid van geleidbaarheid van het aantal open GJs19; echter, het is technisch veeleisende, tijdrovend en duur20. De ik-YFP-GJIC-assay werd ontwikkeld voor gebruik in de HTS.
Figuur 1 illustreert de onderdelen en de stappen van de ik-YFP-GJIC-test, die gebruik maakt van de acceptor cellen uiten een jodide-gevoelige YFP variant, rekening houdend met H148Q en I152L (YFPQL) en donor cellen uiten van een transporter jodide (SLC26A4)21 . De twee mutaties gedragen door YFPQL toestaan blussen van fluorescentie jodide22. Jodiden worden toegevoegd aan mede gekweekte acceptor en donor cellen; ze doen niet de acceptor cellen invoeren, maar worden overgenomen door de SLC26A4 vervoerders aanwezig op de donor cellen. Jodiden in de donor cellen verspreiden via functionerende GJs in aangrenzende acceptor cellen waar ze de YFPQL -fluorescentie quench. Als GJs gesloten of geblokkeerd door remmers, kunt geen jodide de acceptor cellen doven de fluorescentie invoeren. De YFPQL blussen tarief weerspiegelt GJ activiteit. De ik-YFP-procedure voor de bepaling van de GJIC is niet ingewikkeld of tijdrovend. Het is compatibel met HTS en kan worden gebruikt voor het testen van de effecten van een groot aantal verbindingen op GJ activiteit in een relatief korte periode. Het vereist alleen acceptor en donor cellen, en de twee evenwichtige zoutoplossingen. Het hieronder beschreven protocol is gebaseerd op de LN215 cellen waarvan grote Cx Cx4321 is. De LN215-YFPQL -receptor en de LN215-ik− donor cellen werden gegenereerd door transductie met lentivirussen YFPQL of SLC26A421,23te uiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ik-YFP-GJIC-bepaling kan worden gebruikt voor HTS omdat het robuuste, snelle en goedkope. Een HTS-assay robuuste wordt beschouwd als de Z’-factor 0,525bedraagt. Zie Zhang et al. erkend voor een beschrijving van de statistische analyse gebruikt voor de beoordeling van de geschiktheid van HTS assays25. Toen LN215 cellen werden gebruikt, de Z’-factor was > 0,5 zonder enige assay-optimalisatie. Als andere celtypes worden gebruikt in de bepaling en de Z’-factor is < 0,5, de r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, en 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
Riferimenti
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
