Un essai de Communication intercellulaire-jonction iodure-jaune Fluorescent Protein-Gap
Summary
Nous présentons ici un protocole pour un dosage de communication intercellulaire de jonction gap roman conçu pour le criblage à haut débit de gap junction-modulation produits chimiques pour la découverte et l’évaluation toxicologique.
Abstract
Jonctions lacunaires (JL) sont des canaux de la membrane cellulaire qui permettent la diffusion des molécules plus petite que 1 kDa entre des cellules adjacentes. Car ils ont des rôles physiologiques et pathologiques, on besoin de haut débit (HTS) de dépistage tests pour identifier les modulateurs GJ lors d’essais de toxicologie et découverte de drogue. Un dosage de jonction intercellulaire communication (I-YFP-CIJL) roman iodure-jaune fluorescent protein-gap répond à ce besoin. C’est un essai sur les cellules dont les cellules accepteur et donateurs qui ont été conçues pour exprimer stablement une variante de la protéine fluorescente jaune (YFP), dont la fluorescence est sensiblement piégée par iodure ou SLC26A4, un transporteur d’iodure, respectivement. Lorsque l’iodure est ajouté à une culture mixte des deux types cellulaires, ils entrer dans les cellules du donneur via le transporteur SLC26A4 et diffusent vers les cellules adjacentes accepteur via GJs où ils étancher la fluorescence de la YFP. YFP fluorescence est mesurée bien par bien en mode cinétique. Le taux d’extinction YFP reflète l’activité GJ. Le test est fiable et assez rapide à utiliser pour HTS Le protocole de l’essai j’ai-YFP-CIJL à l’aide des LN215 des cellules, cellules de gliome humain, est décrite.
Introduction
Jonctions lacunaires (JL) agissent comme des canaux intercellulaires pour permettre la diffusion de petites molécules de < 1 kDa comme nutriments, métabolites et molécules de signalisation entre des cellules adjacentes. Les éléments jonctionnelles comprennent un hémicanaux ou connexon dans chaque cellule et chaque connexon constitue six connexines (CX)1. JL et CX ont été utilisés dans les essais de toxicologie des carcinogènes comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), qui sont des inhibiteurs GJ2,3,4. CIJL perturbée a été associée par génotoxiques carcinogenèse5,6. Comme une cible thérapeutique potentielle, implication GJ a signalé en particuliers sous-types de saisies7,8, protection du cardiaques et cérébrales ischémie/reperfusion injury9, migraine avec aura10, lésion hépatique induite par le médicament6,11et12de cicatrisation. Tests de dépistage (HTS) haut débit sont nécessaires pour identifier les produits chimiques modulant GJ ou des anticorps pour la découverte de médicaments, pour les tests de toxicologie et d’identifier de nouveaux régulateurs cellulaires d’activité GJ. Tests de HTS permet également d’étudier les relations structure-activité de GJ modulateurs2,13,14,15.
Certains tests CIJL comprennent le transfert de teinture ou de techniques de double patch clamp. Lucifer jaune CH (LY) et calcéine acétoxyméthyl ester (calcéine-AM) ont été utilisés dans des essais de transfert de la teinture. Les cellules ne sont pas perméables à LY, qui est introduit par micro-injection, gratter chargement ou électroporation. Une fois à l’intérieur de la cellule, LY se répand dans les voisins des cellules via GJs et GJ l’activité est mesurée par l’ampleur de la migration de LY16. Tests de Calcéine-AM impliquent généralement récupération de gap-fluorescence après Photoblanchiment17,18. Calcéine-AM est un colorant cellulaire perméable est transformé intracellulairement calcéine imperméable par une estérase intrinsèque. Le test nécessite un microscope confocal pour observer le transfert de calcéine-AM dans une cellule de ceux qui l’entourent après Photoblanchiment laser. Si JL fonctionnels est présents, calcéine-AM dans des cellules adjacentes pénètre dans les cellules de la photobleached et la fluorescence est récupérée. GJ l’activité est mesurée par le degré de récupération de la fluorescence des cellules photobleached. Le transfert de teinture dosages sont laborieux et fastidieux ou ont une sensibilité faible. Patch double serrage est une méthode électrophysiologique qui mesure la conductance jonctionnelle. Il est relativement sensible, avec une dépendance directe de la conductance sur le nombre d’open JL19; Toutefois, il est techniquement difficile, chronophage et coûteux20. Le je-YFP-CIJL a été développé pour une utilisation en HTS
La figure 1 illustre les composants et les étapes du test j’ai-YFP CIJL, qui utilise des cellules accepteur exprimant une variante YFP iodure sensibles portant H148Q et I152L (YFPQL) et donneur de cellules exprimant un transporteur iodure (SLC26A4)21 . Les deux mutations portées par YFPQL permettent l’extinction de fluorescence par iodure22. Iodures sont ajoutés à l’accepteur co cultivée et les cellules du donneur ; ils n’entrent pas dans les cellules de l’accepteur, mais sont absorbés par les transporteurs SLC26A4 présents sur les cellules du donneur. Iodures dans les cellules du donneur diffusent à travers de JL fonctionnel dans les cellules adjacentes accepteur où ils étancher la fluorescence YFPQL . Si JL est fermés ou bloqués par les inhibiteurs, iodure ne peut pas entrer les cellules accepteur pour étancher la fluorescence. Le taux d’extinction YFPQL reflète l’activité GJ. Le mode OPERATOIRE j’ai-YFP CIJL n’est ni compliqué ni votre temps. Il est compatible avec HTS et peut être utilisé pour tester les effets d’un grand nombre de composés sur l’activité GJ dans une période relativement courte. Il faut seulement accepteur et cellules du donneur et deux solutions salines équilibrées. Le protocole décrit ci-dessous est basé sur LN215 cellules dont Cx majeur est Cx4321. Le récepteur LN215-YFPQL et LN215-j’ai− cellules du donneur ont été générés par transduction avec lentivirus exprimant YFPQL ou SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test j’ai-YFP-CIJL peut être utilisé pour HTS parce qu’il est robuste, rapide et peu coûteux. Un dosage HTS est considéré comme robuste si la Z’-facteur est supérieure à 0,525. Voir Zhang et coll. pour obtenir une description de l’analyse statistique utilisée pour évaluer l’adéquation des HTS essais25. Lorsque des cellules LN215 ont été utilisées, le Z’-facteur était > 0,5 sans aucune optimisation de dosage. Si les autres types de cellules sont util…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de l’éducation (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 et 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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