Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per un dosaggio di comunicazione intercellulare di romanzo gap junction progettato per lo screening ad alta resa di prodotti chimici di gap junction-modulanti per drug discovery e valutazione tossicologica.
Abstract
Giunzioni di Gap (GJs) sono i canali della membrana cellulare che permettono la diffusione delle molecole più piccolo di 1 kDa tra celle adiacenti. Come hanno ruoli fisiologici e patologici, c’è necessità di high throughput screening (HTS) saggi di identificare modulatori GJ in drug discovery e tossicologia saggi. Un saggio di comunicazione intercellulare di giunzione (I-YFP-GJIC) romanzo ioduro-giallo fluorescente proteina-gap soddisfa questa esigenza. È un’analisi basata su celle tra cui accettore e donatore di cellule che sono state progettate per esprimere stabilmente una variante della proteina fluorescente gialla (YFP), cui fluorescenza sensibile è spenta mediante ioduro o SLC26A4, un trasportatore di ioduro, rispettivamente. Quando lo ioduro viene aggiunto a una coltura mista di due tipi cellulari, entrano le cellule erogarici tramite il trasportatore SLC26A4 e diffusa alle celle adiacenti acceptor tramite GJs dove essi placare la fluorescenza YFP. YFP fluorescenza è misurata pozzetto da altro in modalità cinetica. Il tasso d’estinzione YFP riflette l’attività GJ. Il test è affidabile e abbastanza veloce da utilizzarsi per HTS Il protocollo per il dosaggio di-YFP-GJIC utilizzando le cellule LN215, cellule di glioma umano, è descritto.
Introduction
Giunzioni di Gap (GJs) fungono da canali intercellulari per consentire la diffusione di piccole molecole di < 1 kDa come nutrienti, metaboliti e molecole di segnalazione tra celle adiacenti. Gli elementi giunzionali includono un hemichannel o una connessone in ogni cellula e ogni connessone costituisce sei connexins (Cxs)1. GJs e Cxs sono stati utilizzati nelle analisi di tossicologia degli agenti cancerogeni quali idrocarburi policiclici aromatici (PAH), che sono GJ inibitori2,3,4. GJIC interrotte è stato associato con nongenotoxic carcinogenesi5,6. Come un potenziale bersaglio terapeutico, GJ partecipazione è stata segnalata in particolari sottotipi di sequestri7,8, protezione da cardiaco e cervello ischemia/riperfusione pregiudizio9, emicrania con aura10, danno epatico farmaco-indotto6,11e12di guarigione della ferita. High throughput screening (HTS) saggi sono tenuti a identificare le sostanze chimiche GJ-modulanti o anticorpi per la scoperta di nuovi farmaci, per le analisi di tossicologia e per identificare nuovi regolatori cellulari della attività GJ. Saggi di HTS è utilizzabile anche per indagare le relazioni struttura-attività di GJ modulatori2,13,14,15.
Alcuni saggi GJIC includono trasferimento della tintura o tecniche di dual patch clamp. Lucifero giallo CH (LY) ed estere di calceina acetossimetil (calceina-AM) sono stati utilizzati nelle analisi di dye-transfer. Le cellule non sono permeabili a LY, che è stato introdotto da microiniezione, raschiare caricamento o elettroporazione. Una volta all’interno della cellula, LY si diffonde nelle vicine cellule via GJs e attività GJ è analizzata dalla misura del LY migrazione16. Saggi di calceina-AM coinvolgono di solito recupero di gap-fluorescenza dopo photobleaching17,18. Calceina-AM è un cellulare-permeante colorante che è convertito intracellulare in calceina impermeabile da un intrinseco dell’esterasi. Il test richiede un microscopio confocale per osservare il trasferimento di calceina-AM in una cella da coloro che la circondano dopo laser photobleaching. Se GJs funzionale sono presenti, la fluorescenza viene recuperata e calceina-AM in celle adiacenti entra nelle cellule photobleached. Attività GJ è analizzata dalla misura di recupero di fluorescenza delle cellule photobleached. Sublimazione saggi sono laboriosa e che richiede tempo o hanno basse sensibilità. Dual patch di bloccaggio è un metodo elettrofisiologico che misura di conduttanza giunzionale. È relativamente sensibile, con una dipendenza diretta della conduttanza al numero di open GJs19; Tuttavia, è tecnicamente esigente, richiede tempo e costoso20. L’analisi YFP-GJIC è stata sviluppata per l’uso in HTS
La figura 1 illustra i componenti e i passaggi del test GJIC-YFP, che utilizza celle acceptor esprimendo una variante YFP ioduro sensibili cuscinetto H148Q e I152L (YFPQL) e le cellule erogarici esprimendo un trasportatore di ioduro (SLC26A4)21 . Le due mutazioni di YFPQL consentono tempra di fluorescenza di ioduro22. Gli ioduri vengono aggiunti al co-coltivate acceptor e cellule del donatore; Essi non entrano le cellule accettore, ma sono presi dai trasportatori SLC26A4 presenti sulle cellule del donatore. Gli ioduri nelle cellule del donatore si diffondono attraverso GJs funzionante in celle adiacenti acceptor dove essi placare la fluorescenza YFPQL . Se GJs sono chiuso o bloccato dagli inibitori, ioduro non può entrare nelle cellule di acceptor per placare la fluorescenza. Il tasso d’estinzione YFPQL riflette l’attività GJ. La procedura di dosaggio-YFP GJIC è né complicato né in termini di tempo. È compatibile con HTS e può essere utilizzato per verificare gli effetti di un gran numero di composti su GJ attività in un periodo relativamente breve. Richiede solo acceptor e cellule del donatore e due soluzioni saline bilanciate. Il protocollo descritto di seguito è basato su cellule LN215 cui principali Cx è Cx4321. Il ricevitore di LN215-YFPQL e LN215-sono cellule erogarici− sono state generate da trasduzione con lentivirus esprimere YFPQL o SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi YFP-GJIC può essere usata per HTS perché è robusto, veloce e poco costoso. Un’analisi HTS è considerata robusta se la Z’-factor è superiore a 0,525. Vedere Zhang et per una descrizione dell’analisi statistica utilizzata per valutare l’idoneità del sistema HTS dosaggi25. Quando le cellule LN215 sono state usate, la Z’-fattore era > 0,5 senza alcuna ottimizzazione del dosaggio. Se vengono utilizzati altri tipi di cella nel dosaggio e suo Z’-fattore è < 0,5, l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della pubblica istruzione (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 e 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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