ヨウ化黄色蛍光タンパク質ギャップ結合細胞間コミュニケーション アッセイ
Summary
ここでは、ギャップ ジャンクション変調化学薬品、薬剤の発見および毒性評価の高スループット スクリーニング用に設計された新しいギャップ接合細胞間コミュニケーション試金のためのプロトコルを提案する.
Abstract
ギャップ結合 (GJs) は、隣接するセル間 1 kDa より小さい分子の拡散を許可する細胞膜チャンネルです。彼らは、生理学的および病理学的役割を持っていると薬の発見と毒性の試金の GJ 変調器を識別するハイスループットス クリーニング (HTS) 試金の必要があります。新規ヨウ化黄色蛍光タンパク質-ギャップ結合細胞間コミュニケーション (私-YFP-ギャップ) アッセイは、この必要性を満たしています。安定の蛍光はそれぞれ急冷ヨウ化、または SLC26A4、ヨウ化物輸送によって敏感に黄色い蛍光蛋白質 (YFP) バリアントを表現する設計されてアクセプターと提供者の細胞を含む細胞ベースのアッセイです。2 つのセル型の混合培養にヨウ化を追加すると、彼らは SLC26A4 トランスポーターを介してドナー細胞を入力し、YFP の蛍光をいやす GJs を介して隣接する受容体細胞に拡散します。YFP の蛍光は、キネティック モードでもが測定されます。YFP の失活速度は、GJ のアクティビティを反映しています。試金は信頼性が高く、十分な HTS. に使用される急速ですひと神経膠腫細胞 LN215 細胞を用いて YFP-ギャップの試金のためのプロトコルを説明します。
Introduction
ギャップ結合 (GJs) の小分子の拡散を許可する細胞間のチャネルとして < 1 kDa の栄養素、代謝産物、隣接する細胞間シグナル伝達分子など。接合部の要素は、各セルに hemichannel またはコネクソンを含めるし、各コネクソンはコネキシン (Cxs) 61を構成します。GJs と Cxs 多環芳香族炭化水素 (PAH) GJ 阻害剤2,3,4であるなどの発癌物質の毒性アッセイに使用されています。混乱ギャップは非遺伝毒性発癌5,6に関連付けられています。発作7、8心臓と脳虚血・再灌流傷害9、10のオーラを伴う片頭痛からの保護の特定のサブタイプの潜在的な治療上のターゲットとして GJ の関与が報告されています。薬物性肝障害6,11, および創傷治癒12。ハイスループットス クリーニング (HTS) 試金が GJ 変調化学物質や毒物学の試金のための薬剤の発見のための抗体を識別し、GJ 活動の新しい細胞調節を識別するために必要です。HTS アッセイは、GJ 変調2,13,14,15の構造活性相関を調査にも使用できます。
いくつかのギャップのアッセイは、熱転写またはデュアル パッチク ランプ法に含まれます。ルシファー黄色 CH (LY) およびカルセイン アセトキシメチルセファロスポリン エステル (カルセイン AM) は、熱転写の試金で使用されています。セルは LY マイクロインジェクション、読み込み、こすりまたはエレクトロポレーションで導入された透過性はありません。一度細胞内 LY は隣接セルを介してGJs に広がっており、GJ 活動は LY 移行16の範囲によって試金されます。カルセイン AM の試金は通常フォトブリーチング17,18後ギャップ蛍光回復を含みます。カルセイン AM は、不浸透性のカルセインに本質的なエステラーゼによって細胞内変換はセル側の透過物染料です。アッセイでは、共焦点顕微鏡レーザー光に続くそれを取り囲むものからセルにカルセイン AM の転送を観察する必要があります。機能 GJs が存在する場合、隣接するセルにカルセイン AM photobleached 細胞に入るし、蛍光の回復します。GJ 活動が photobleached 細胞の蛍光回復の程度によって試金されます。熱転写の試金は手間と時間がかかることも低感度。デュアル パッチ クランプ接合コンダクタンスを測定する電気生理学的手法です。それは比較的敏感、オープン GJs19; 数コンダクタンスの直接依存性しかし、それは技術的に難しく、時間がかかり、高価な20。HTS. で開発された YFP-ギャップ測定
図 1は、コンポーネントとベアリング H148Q および I152L ヨウ化感応 YFP バリアントを発現する受容体細胞を利用して – YFP ギャップ分析の手順を示しています (YFPQL) とヨウ化物輸送 (SLC26A4) を表現するドナー細胞21.YFPQLによって運ばれる 2 つの突然変異は、ヨウ化22による蛍光の消光を許可します。沃化物が共存培養アクセプタとドナー細胞に追加されます。彼らは受容体細胞を入力しないが、ドナー細胞の存在 SLC26A4 トランスポーターによってとられます。沃化物ドナー細胞の拡散機能 GJs YFPQL蛍光いやす隣接する受容体細胞に。GJs が終了または阻害剤によってブロックされている場合、ヨウ化は蛍光を抑制する受容体細胞を入力できません。YFPQLの失活速度は、GJ のアクティビティを反映しています。YFP ギャップ試金プロシージャ複雑でも時間がかかる。高温超伝導との互換性であり、比較的短い期間で多数の化合物が GJ 活性に及ぼす影響をテストに使用することができます。アクセプタ ドナー細胞と 2 つのバランスの取れた塩のソリューションを必要があります。下記プロトコルは、その主要な Cx が配列とコネキシン 4321LN215 セルに基づいています。LN215 YFPQL受容体と LN215-私−ドナー細胞が異 YFPQLまたは SLC26A421,23を表現すると伝達によって生成されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
堅牢・迅速かつ安価なので、高温超伝導の YFP ギャップ分析を使用できます。HTS アッセイは、堅牢なと見なされます場合 Z’-0.525上記要因です。「高温超伝導体の適合性を評価するために使用する統計解析説明の張ら25の試金します。LN215 セルを使用すると、Z’-要因だった > 任意のアッセイの最適化なし 0.5。他の細胞型、試金およびその Z で使用されます ‘-?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 教育省によって資金を供給によって支えられた (2011-0023701、2016R1D1A1A02937397、および 2018R1A6A1A03023718)。
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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