요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 분석 결과
Summary
여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
간격 접속점 (GJs)는 인접 한 셀 사이의 1 kDa 보다 작은 분자의 유포를 허용 하는 세포 막 채널. 그들은 생리 적 및 병 적인 역할을가지고, 약물 발견과 독물학 분석에서 글리제 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험의 필요가 있다. 소설 요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 (난-YFP-GJIC) 분석 결과 수행이 필요 합니다. 그것은 안정적으로 노란 형광 성 단백질 (YFP) 변종, 그 형광은 요오드 화물, 또는 요오드 화물 운송업 자 SLC26A4 각각 침묵 민감하게 표현 하 설계는 기증자와 수락자 셀을 포함 하 여 세포 기반 분석 결과. 요오드 화물을 혼합된 문화는 두 종류의 세포에 추가 될 때 그들은 SLC26A4 전송 통해 기증자 세포를 입력 하 고 어디 그들이 YFP 형광 담금질 GJs 통해 인접 수락자 셀에 확산. YFP 형광 운동 모드에서 잘에 의해 잘 측정 된다. YFP 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. 분석 결과 신뢰성과 HTS.에 사용 될 만큼 빠른 인간의 glioma 세포, LN215 세포를 사용 하 여 YFP-GJIC 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
간격 접속점 (GJs) 역할의 작은 분자의 확산을 허용 하도록 작성 채널 < 영양소, 대사 산물, 등 인접 한 셀 사이의 신호 분자 1 kDa. 접합 요소는 각 셀에 hemichannel 또는 connexon 포함 하 고 각 connexon 구성 6 connexins (Cxs)1. GJs 및 Cxs 글리제 억제제2,,34인 내는 다 환 방향족 탄화수소 (PAH) 등 발암 물질의 독성 분석 실험에 사용 되었습니다. 교란된 GJIC nongenotoxic 발암5,6와 연결 되었습니다. 잠재적인 치료 대상으로 GJ 참여 발작7,8, 심장 및 뇌 허 혈/reperfusion 상해9, 오 라10, 편두통에서에서 보호의 특정 하위에서 보고 되었습니다. 약물 유발 간 부상6,11, 그리고 상처 치유12. 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험은 글리제 변조 화학 물질이 나 독성 분석 실험에 대 한 약물 발견에 대 한 항 체를 식별 하 고 글리제 활동의 소설 셀룰러 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 필요 합니다. HTS 분석 또한 글리제 변조기2,13,,1415의 구조 활동 관계를 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.
일부 GJIC 분석 실험 염료 전송 또는 듀얼 패치 클램프 기술 포함. 루시퍼 노란색 채널 (LY)와 calcein acetoxymethyl 에스테 르 (calcein-오전) 염료 전송 분석 실험에 사용 되었습니다. 셀 정, microinjection, 로드, 흠집이 나 electroporation에 의해 도입에 융 화 되지 않습니다. 일단 셀 안에 서둘러 이웃 셀 통해 GJs에 확산 하 고 글리제 활동 LY 마이그레이션16의 범위에 의해 분석 키를 누릅니다. Calcein 오전 분석 실험은 일반적으로 photobleaching17,18후 갭 형광 복구를 포함 한다. Calcein 오전은 침으로 스며들 지 않는 calcein에 의해 변환 본질적인 esterase 셀 permeant 염료 이다. 분석 결과 관찰 된 레이저 photobleaching 다음에서 셀에 calcein 오전의 전송 하는 confocal 현미경을 필요 합니다. 기능 GJs 존재 하는 경우 인접 한 셀에 calcein 오전 photobleached 세포를 입력 하 고 형광 복구 됩니다. 글리제 활동은 photobleached 셀의 형광 복구의 범위에 의해 분석 됩니다. 염료 전송 분석 힘들고 시간이 걸리는 또는 낮은 감도 있다. 이중 패치 클램핑 접합 계수 측정 electrophysiological 방법입니다. 그것은 상대적으로 민감한, 오픈 GJs19; 수에 전도성의 직접적인 의존 그러나, 그것은 기술적으로 요구, 시간이 소모 및 비싼20. YFP-GJIC 분석 결과 HTS.에 사용 하기 위해 개발 되었다
그림 1 에서는 구성 요소와 베어링 H148Q 및 I152L 요오드 화물-민감한 YFP variant를 표현 하는 수락자 셀을 이용 하는-YFP GJIC 분석 결과의 단계 (YFPQL) 및 기증자 세포는 요오드 화물 운송업 자 (SLC26A4) 표현21 . 두 돌연변이 YFPQL에 의해 수행 요오드 화22형광의 냉각 허용 합니다. Iodides 공동 경작된 수락자와 기증자 세포;에 추가 됩니다. 그들은 수락자 셀을 입력 하지 마십시오 하지만 기증자 세포에 존재 SLC26A4 전송기에 의해 채택 됩니다. Iodides 기증자 세포에서 인접 한 수락자 세포 어디 그들이 YFPQL 형광 담금질로 작동 GJs 통해 확산 한다. 만약 GJs 폐쇄 또는 억제제에 의해 차단, 요오드 화물 수락자 셀 형광 담금질을 입력할 수 없습니다. YFPQL 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. YFP GJIC 분석 결과 절차는 복잡 하지도 않고 시간이 소요. HTS와 호환 이며, 상대적으로 짧은 기간에 글리제 활동에 많은 화합물의 효과 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 수락자와 기증자 세포, 그리고 두 개의 균형된 소금 솔루션을 필요합니다. 아래에서 설명 하는 프로토콜의 주요 Cx는 Cx4321LN215 셀을 기반으로 합니다. LN215-YFPQL 수용 체 및 LN215-내가− 기증자 세포는 lentiviruses YFPQL 또는 SLC26A421,23표현으로 변환에 의해 생성 된.
Protocol
Representative Results
Discussion
YFP-GJIC 분석 결과 때문에, 급속 한, 강력 하 고 저렴 한 HTS에 대 한 사용할 수 있습니다. HTS 분석 결과 강력한 간주 됩니다 경우 Z’-요소 0.525이상입니다. 참조 장 그 외 여러분 HTS 분석25의 적합성을 평가 하는 데 사용 하는 통계 분석에 대 한. LN215 셀 사용 했다 Z’-요소 > 어떤 분석 결과 최적화 없이 0.5. 다른 세포 유형 분석 결과 및 그것의 Z에 사용 됩니다 ‘-요소는 <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 교육부의 재정 지원에 의해 지원 되었다 (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, 및 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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