Иодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи Assay
Summary
Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.
Abstract
Разрыв соединения (GJs) являются каналы клеточной мембраны, которые позволяют диффузии молекул меньше 1 кДа между соседними ячейками. Как они физиологических и патологических ролей, существует необходимость высокопроизводительного скрининга (HTS) анализов для выявления GJ модуляторы в наркотиками открытий и токсикологии анализов. Роман йодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи (I-рекламы ЯФП-GJIC) пробирного удовлетворяет эту потребность. Это на основе ячеек пробирного, включая доноров и акцепторов клетки, которые разработаны для стабильно Экспресс вариант желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП), чьи флуоресценции чутко закаленном йодида, или SLC26A4, иодид транспортер, соответственно. Когда йодида добавляется к смешанной культуре клеток двух типов, они ввести клеток донора через SLC26A4 транспортер и диффузного в прилегающих акцептора клетки через GJs где они утолить рекламы ЯФП флуоресценции. Рекламы ЯФП флуоресценции измеряется от скважины в кинетическую режиме. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФП. Assay надежный и быстрый, чтобы использоваться для Хайтс Протокол assay рекламы ЯФП-GJIC с использованием LN215 клеток, клеток глиомы человека, описал.
Introduction
Разрыв соединения (GJs) выступать в качестве межклеточного каналы, чтобы разрешить распространение малых молекул < 1 кДа таких питательных веществ, метаболитов и сигнальных молекул между соседними ячейками. Соединительной элементы включают hemichannel или Коннексоны в каждой ячейке, и каждый Коннексоны представляет собой шесть connexins (Cxs)1. GJs и Cxs были использованы в токсикологии анализов канцерогенных веществ таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые являются GJ ингибиторы2,3,4. Нарушена GJIC был связан с nongenotoxic канцерогенез5,6. Как потенциальной терапевтической цели ГДЖ участие было сообщено в частности подтипы изъятий7,8, защита от сердца и мозга ишемии/реперфузии травмы9, мигрень с аурой10, лекарственно индуцированные травма печени6,11и ранозаживляющее12. Высокопроизводительного скрининга (HTS) анализы необходимы для выявления GJ-модулирующих химических веществ или антител для обнаружения наркотиков, для анализов токсикологии и выявления роман сотовой регуляторы активности GJ. HTS анализов может также использоваться для расследования связей структура активность GJ модуляторы2,13,,1415.
Некоторые GJIC анализы включают переноса красителя или двойной патч зажим методов. Люцифер желтый чемпион (LY) и Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) были использованы в красителях передача анализов. Клетки не проницаемой для LY, который вводится путем микроинъекции, лом загрузки или электропорации. Раз внутри клетки, LY распространяется на соседние клетки через GJs и GJ деятельность assayed масштабы миграции LY16. Флуорексон-ам анализов обычно включают в себя разрыв флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание17,18. Флуорексон-ам является клеток permeant красителем, который внутриклеточно преобразован в непроницаемой Флуорексон внутренней эстеразы. Assay требует Конфокальный микроскоп для наблюдения за передачей Флуорексон ам в клетку от окружающих его после лазерной Фотообесцвечивание. Если функциональные GJs присутствуют, Флуорексон ам в соседних ячейках входит photobleached клеток и флуоресценции восстанавливается. GJ активность assayed по степени восстановления флуоресценции клеток photobleached. Анализы на красителях передача кропотливая и требует много времени или низкой чувствительности. Зажим двойной патч является электрофизиологических метод, который измеряет соединительной проводимости. Это относительно чувствительных, с прямая зависимость проводимости на количество открытых GJs19; Однако она является технически сложным, трудоемким и дорогим20. Assay рекламы ЯФП-GJIC был разработан для использования в Хайтс
Рисунок 1 иллюстрирует компоненты и действия рекламы-ЯФП GJIC assay, который использует акцептора клетки, выражая вариант рекламы ЯФП йодид чувствительных, H148Q и I152L (QLрекламы ЯФП) и клеток донора, выражая йодида транспортера (SLC26A4)21 . Две мутации, перевозимых рекламы ЯФПQL позволяют тушения флуоресценции йодида22. Йодиды добавляются к совместно культивируемых акцептора и клеток донора; не вводите акцептора клетки, они принимаются до настоящего SLC26A4 транспортеры на клеток донора. Йодиды в клеток донора диффундируют через функционирование GJs в прилегающих акцептора клетки, где они утоляют рекламы ЯФПQL флуоресценции. Если GJs закрыты или заблокированы ингибиторы, йодида нельзя ввести акцептора клетки, чтобы утолить флуоресценции. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФПQL . Процедура анализа GJIC рекламы-ЯФП сложным ни много времени. Он совместим с HTS и может использоваться для проверки воздействия большого числа соединений на ГДЖ активность в течение относительно короткого периода. Он требует только акцептора и клеток донора и два сбалансированных солевых растворов. Протокол, в описанный ниже основывается на LN215 клетки, чьи основные Cx-Cx4321. LN215-рекламы ЯФПQL рецепторов и LN215-я− доноров клеток были порожденных трансдукция с lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL или SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay рекламы ЯФП-GJIC может использоваться для HTS, потому что это надежный, быстрый и недорогой. HTS assay считается надежной Если Z’-фактор превышает 0,525. Смотреть Zhang et al. для описания статистического анализа, используемый для оценки пригодности HTS анализов25. Когда LN215 к?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 и 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
Riferimenti
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
