नेइसेरिया gonorrhoeae समुच्चय के एंटीबायोटिक संवेदनशीलता की मात्रात्मक परीक्षा एटीपी उपयोग वाणिज्यिक परख और जीने/मृत धुंधला
Summary
एक साधारण एटीपी-परख और जीवित/मृत धुंधला विधि को मापने और ceftriaxone के साथ उपचार के बाद नेइसेरिया gonorrhoeae अस्तित्व कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल को किसी भी एंटीबायोटिक के रोगाणुरोधी प्रभाव की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और बैक्टीरियल फिल्म में एंटीबायोटिक दवाओं की ंयूनतम निरोधात्मक एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
एंटीबायोटिक प्रतिरोधी नेइसेरिया gonorrhoeae (जीसी) के उद्भव एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य खतरा है और जो लोग इलाज असफल की पहचान करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया । इस ग्राम-नकारात्मक जीवाणु का कारण बनता है सूजाक विशेष रूप से मनुष्यों में । संक्रमण के दौरान, यह समुच्चय के रूप में सक्षम है और/ न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) परीक्षण एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए और उचित उपचार को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, vivo में उंमूलन और उसके संबंध प्रयोगशाला परिणामों के लिए तंत्र का पता नहीं है । एक तरीका है कि कैसे GC एकत्रीकरण एंटीबायोटिक संवेदनशीलता को प्रभावित करता है और कुल आकार और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता के बीच संबंध से पता चलता है की जांच का विकास किया गया था । जब जीसी कुल, वे और अधिक एंटीबायोटिक की हत्या के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, ceftriaxone उपचार की परिधि में उन लोगों से बेहतर केंद्र में बैक्टीरिया के साथ । डेटा इंगित करता है कि N. gonorrhoeae समुच्चय ceftriaxone करने के लिए अपनी संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं, जो मानक आगार प्लेट आधारित MIC तरीकों का उपयोग कर प्रतिबिंबित नहीं है । इस अध्ययन में इस्तेमाल विधि शोधकर्ताओं नैदानिक प्रासंगिक स्थितियों के तहत बैक्टीरियल संवेदनशीलता का परीक्षण करने की अनुमति देगा ।
Introduction
सूजाक एक आम यौन संचारित संक्रमण (STI)1है । नेइसेरिया gonorrhoeae (GC), एक ग्राम नकारात्मक diplococcal जीवाणु, इस रोग का प्रेरणा का एजेंट है । जननांग संक्रमण के लक्षण पेशाब के दौरान दर्द में परिणाम कर सकते हैं, सामान्यीकृत जननांग दर्द, और मूत्रमार्ग निर्वहन । संक्रमण अक्सर स्पर्शोन्मुख2,3,4,5, और यह विस्तारित औपनिवेशीकरण के लिए अनुमति देता है । ये अनुपचारित संक्रमण एक प्रमुख स्वास्थ्य चिंता का विषय है, क्योंकि वे शरीर के संचरण की सुविधा के लिए क्षमता है और इस तरह श्रोणि भड़काऊ रोग (PID) और प्रसार gonococcal संक्रमण (DGI)6के रूप में जटिलताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एंटीबायोटिक प्रतिरोधी सूजाक एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य संकट और एक बढ़ती सामाजिक बोझ7है । सेफालोस्पोरिन्स को कम संवेदनशीलता एक एंटीबायोटिक से उपचार आहार परिवर्तन में हुई है दोहरी थेरेपी, जो8ceftriaxone के साथ azithromycin या doxycycline को जोड़ती है । ceftriaxone और azithromycin9,10, स्पर्शोन्मुख संक्रमण के साथ संयोजन में वृद्धि की विफलता, सूजाक उपचार विफलताओं को समझने के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला गया ।
न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) परीक्षण, आगर कमजोर पड़ने और डिस्क प्रसार परीक्षण सहित, एक एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोध की पहचान करने के लिए मानक चिकित्सा परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. फिर भी, यह स्पष्ट नहीं है अगर MIC परीक्षण vivo में बैक्टीरियल एंटीबायोटिक प्रतिरोध को दर्शाता है । बैक्टीरियल फिल्म के गठन एंटीबायोटिक के जीवाणुनाशक सांद्रता की उपस्थिति में बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए योगदान देता है: MIC परीक्षण इस प्रभाव11का पता लगाने में असमर्थ है. क्योंकि gc12सतहों श्लैष्मिक पर फिल्म फार्म कर सकते हैं, हम परिकल्पना कि समुच्चय के भीतर एंटीबायोटिक संवेदनशीलता व्यक्तिगत GC में देखा है कि से अलग हो जाएगा । इसके अतिरिक्त, अध्ययनों से पता चला है कि तीन चरण चर सतह अणु, पिली, अस्पष्टता से जुड़े प्रोटीन (Opa), और lipooligosaccharides (लॉस), कि अंतर जीवाणु बातचीत को विनियमित, विभिंन आकार समुच्चय13के लिए सीसा, 14 , 15. एंटीबायोटिक प्रतिरोध करने के लिए इन घटकों के योगदान की जांच उचित तरीकों के अभाव के कारण नहीं की गई है ।
वर्तमान में, फिल्म उन्मूलन को मापने के लिए कई विधियाँ हैं । सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मात्रात्मक विधि बायोमास क्रिस्टल बैंगनी दाग16का उपयोग कर में परिवर्तन को मापने के द्वारा है । हालांकि, विधि महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक हेरफेर, जो संभावित रूप से प्रयोग में त्रुटियाँ उत्पन्न कर सकते हैं17दोहराता है की आवश्यकता है । जीवित/मृत धुंधला विधि यहां इस्तेमाल किया जीने और मृत बैक्टीरिया और उनके वितरण के दृश्य के भीतर फिल्म की अनुमति देता है । हालांकि, फिल्म संरचना एक शारीरिक बाधा है कि डाई पैठ कम कर देता है के रूप में मुद्रा कर सकते हैं । इसलिए, एक समूह के भीतर जीवित/मृत जीवाणुओं का अंदाजा लगाने के लिए, दाग छोटी सी फिल्म या उसके प्रणेता-microcolonies या एकत्रीकरण तक सीमित है । आगर कमजोर पड़ने और डिस्क प्रसार परीक्षणों सहित अन्य तरीकों से एकत्रीकरण के प्रभाव को मापने में सक्षम नहीं हैं । एंटीबायोटिक एक्सपोजर के बाद एकत्रीकरण के भीतर जीसी संवेदनशीलता की जांच करने के लिए, एक आदर्श विधि दोनों एक मात्रात्मक परख कि जीवित बैक्टीरिया को मापने और उनके वितरण कल्पना कर सकते है की आवश्यकता होगी ।
यहां वर्णित प्रक्रिया को एक एटीपी-उपयोग माप और एक जीवित/मृत धुंधला परख को मात्रात्मक और नेत्रहीन एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में समुच्चय के भीतर जीसी संवेदनशीलता की जांच को जोड़ती है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरिया मानव शरीर के संक्रमण के दौरान एक फिल्म फार्म कर सकते हैं । पारंपरिक MIC परीक्षण एकाग्रता के लिए एक फिल्म में बैक्टीरिया उंमूलन की जरूरत को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । एक फिल्म पर रोगाणुरोध…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से D.C.S. और एंडरसन AI123340 के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एल-C.W., J.W., एसी, और E.N. भाग में समर्थन किया गया/”प्रथम वर्ष के नवाचार & अनुसंधान अनुभव” मैरीलैंड विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित कार्यक्रम में भाग लेते हैं । funders अध्ययन डिजाइन में कोई भूमिका नहीं थी, डेटा संग्रह, और विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी । हम सभी सूक्ष्म प्रयोगों के लिए UMD CBMG इमेजिंग कोर स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
Riferimenti
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
