Dictyostelium discoideum er en populær model organisme at studere komplekse cellulære processer såsom celle migration, endocytose og udvikling. Nytten af organismen er afhængig af muligheden for genmanipulation. Vi præsenterer her, metoder til at transfect Dictyostelium discoideum celler, at overvinde eksisterende begrænsninger af dyrkningsbaserede celler i flydende medier.
Dictyostelium discoideum er en spændende model organisme for studiet af celle differentiering processer under udvikling, celle signalering, og andre vigtige cellebiologi spørgsmål. De tilgængelige at genmanipulere Dictyostelium celler teknologier er veludviklet. Transfections kan udføres ved hjælp af forskellige valgbare markører og markør igen cykling, herunder homologe rekombination og pattedyrsceller mutagenese. Dette understøttes af et godt kommenteret genom. Men disse tilgange er optimeret til axenic cellelinjer vokser i flydende kulturer og er vanskelige at anvende til ikke-axenic wild-type celler, der lever kun af bakterier. De mutationer, der findes i axenic stammer forstyrre Ras signalering, forårsager overdreven macropinocytosis kræves til fodring, og forringe celle migration, som tilintetgør fortolkning af signaltransduktion og chemotaxis eksperimenter i disse stammer. Tidligere forsøg på at genmanipulere ikke-axenic celler har manglet effektivitet og krævede komplekse eksperimentelle procedurer. Vi har udviklet en simpel Transfektion protokol, der for første gang, overvinder disse begrænsninger. Disse serier af store forbedringer til Dictyostelium molekylær genetik tillade wild-type celler til at være manipuleret så let som standard laboratorium stammer. Ud over fordelene for at studere ufordærvede signalering og motilitet processer, kan mutanter, der forstyrrer macropinocytosis-baserede vækst nu let isoleret. Derudover er hele Transfektion arbejdsprocessen meget fremskyndet, med rekombinant celler, der kan genereres i dage snarere end uger. En anden fordel er, at molekylær genetik yderligere kan udføres med frisk isolerede vildtype Dictyostelium prøver fra miljøet. Dette kan bidrage til at udvide anvendelsesområdet for metoder, der anvendes i disse forskningsområder.
Dictyostelium -slægten er jordlevende sociale amøbe, der primært lever af bakterier. Lægges i phylum Amoebozoa, et stort antal arter er blevet isoleret, kan inddeles i fire forskellige klader1. Arter Dictyostelium discoideum (D. discoideum) er blevet en populær model organisme at studere komplekse cellulære processer såsom celle migration og fagocytose. At kontrollere og standardisere forsøgsbetingelser, axenic celle linjer er blevet udviklet, som er i stand til at vokse i komplekse eller definerede flydende medium i mangel af bakterier2. Af særlig betydning er Ax2, Ax3, og Ax4 stammer, som blev genereret i 1970 ‘ erne og i sidste ende stammer fra en enkelt vild isolere NC43. Værktøjer til genteknologi blev udviklet i disse axenic stammer, hvilket resulterer i den første offentliggjorte knockout i 19874,5. Protokoller blev yderligere udviklet og optimeret til brug under axenic forhold6,7.
Tilpasning af disse protokoller til wild-type D. discoideum stammer, der ikke er i stand til at vokse i flydende bouillon har været forsøgt af flere laboratorier. Men dette er ikke blevet fuldt ud vellykket da Transfektion protokoller er komplekse og manglende effektivitet, delvis på grund af kapacitet af bakterierne til at fungere som en vask for selektiv reagenser8,9. Som et resultat, kommer det væsentlige alle molekylære data på D. discoideum fra efterkommere af en enkelt vildtype isolat. Vi ønskede at overvinde denne begrænsning og udvikle en metode til at genetisk ændre D. discoideum celler uafhængigt af deres evne til at vokse i flydende substrat. Behovet for en sådan metode kan forklares ved den konstatering, at det blev antaget i fortiden, at mutationer giver mulighed axenic vækst var overvejende neutrale og ikke forringe celle fysiologi. Denne antagelse er kun delvist korrekt. Generelt er der to markante forskelle; først, mellem de forskellige isoleret axenic stammer, og for det andet, hvornår disse axenic stammer er sammenlignet med ikke-axenic vilde isolater8,9.
Måske er den mest kritiske faktor den vigtigste axenic gen, axeB, der blev identificeret for nylig som RasGAP NF1. Den vigtigste funktion af NF1 som en RasGAP er at begrænse Ras aktivitet3. Sletning af enzym i alle axenic stammer fører til overdreven Ras aktivitet manifesteret som dannelsen af store aktive Ras patches. Disse udvidede Ras patches føre til ophobning af PIP3 i plasma membranen. De tilfældigt optræder lapper af PIP3 og aktiv Ras er en skabelon for dannelsen af en cirkulær flæse, der til sidst lukkes og fører til dannelsen af macropinosomes10. Konsekvensen er en for stor stigning i macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis er en actin-drevet proces. En konkurrence for cytoskeletal komponenter for dannelsen af enten macropinosomes eller pseudopods er resultatet. Dens indvirkning på celle adfærd er afspejlet i den næsten komplet forebyggelse af chemotaxis vegetative celler til folat11. De massivt forstørret PIP3 patches er meget persistent. Selv i sultet celler, PIP3 patches forblive og kan mistolkes som pseudopods, som kan forårsage problemer tolkning undersøgelser på chemotaxis til lejren.
I nogle tilfælde er NF1 mutation eksperimentelt nyttige. Dette fører os til en anden motivation for at udvikle en Transfektion metode for bacterially dyrket D. discoideum celler, da stigningen i macropinocytosis sats gør axenic celler værdifulde for at undersøge grundlæggende aspekter af denne proces12 . Mutation i de gener, der er nødvendige for macropinocytosis, som Ras og PI3-kinaser10, har dog næsten afskaffet axenic vækst, hvilket gør det nødvendigt at manipulere disse celler gennem vækst på bakterier. En anden grund, der gengiver bakterier-baseret transfections værdifulde er den øgede anvendelse af Dictyostelids til at undersøge spørgsmål i udviklingen af multi celleforandringer13,14, kin anerkendelse15,16, og altruistiske cellulære adfærd, som hovedsagelig afhænger af anvendelsen af frisk isolerede vildtype isolerer17. Alle nævnte forskningsområder kan lettes ved effektive metoder til genetisk manipulation af vilde isolater, som er ikke-axenic og dyrker ikke i flydende bouillon.
Vores protokoller giver mulighed for at overvinde de beskrevne begrænsninger. Tilsammen, mulighed for at udføre genetiske manipulationer med bakteriel vokset D. discoideum celler rummer fordele for alle Dictyostelium forskere, selv om det er bare den øget hastighed af udvælgelsesprocessen grund hurtigere vækst af amoeba (4 h fordobling tid) på bakterier i forhold til væksten i axenic medier (10 h fordobling tid).
Brug af ikke-axenic, wild-type Dictyostelium celler har været meget begrænset hidtil i molekylær forskning. Tilgængelige metoder til genetisk modificering af disse stammer har manglet pålidelighed og effektivitet23, forhindrer deres generelle vedtagelse. De genererede materialer og protokoller præsenteres her kan bruges til enhver D. discoideum stamme uafhængigt af dens evne til at vokse i flydende substrat. Det bør nævnes, at denne protokol er optimeret til NC4-afledte cellelinjer. Transfektion effektivitetsgevinster for frisk isolerede stammer fra naturen adskiller sig fra NC4, som vi har observeret før og er vist her for V12M2 og WS21628,9. Elektroporation betingelser synes især at have en betydelig indflydelse på Transfektion effektivitet og kan kræve yderligere optimering for nogle stammer. Generelt, en tilstrækkelig mængde af transfectants er blevet observeret i alle stammer testet hidtil, viser, at disse metoder er gennemførlige. Antallet af positive transfectants opnås ved hjælp af NC4-afledte stammer er højere i forhold til andre ikke-axenic stammer, wild-type, men i alle tilfælde, er tilstrækkeligt antal transfectants opnået for at give mulighed for yderligere eksperimenter. Det, plus enkelheden af vores protokol, er en stor forbedring i forhold til tidligere forsøg på8,9.
Disse nye ikke-axenic protokoller dække alle genetiske standardprocedurer og tilføje yderligere fordele, da transfections kan udføres hurtigt og effektivt i parallel. Positive kloner fås i dage snarere end uger, siden vækst på bakterier halvdele division tid. De nyoprettede plasmider også arbejder under axenic forhold og kan være rutinemæssigt anvendes under begge vækstbetingelser, der er en anden udvikling af denne methology22. Som blev indført i protokollen, plasmid brugt til valg på bakterier har særlige krav, der er afgørende for succes af Transfektion. Især er initiativtagerne kørsel udtryk og modstand-kassetter vigtige for vellykket Transfektion. Ofte brugte act6 (aktin 6) promotor24 for at køre modstand eller udtryk kassetter mangler effektivitet, når celler dyrkes på bakterier. I vores plasmid system drev meget aktive act15 (aktin 15) selskabet alle udtryk kassetter, mens modstand kassetter er under kontrol af en coA (coactosin A) promotor, både som er aktiv på axenic vilkår og i celler dyrkes på bakterier. Krav til udtryk for reporter konstruktioner samt knock-i og knock-out konstruktioner gør det nødvendigt at bruge vores plasmid repertoire, men desværre begrænser brugen af vektorer allerede oprettet som bruger ineffektive act6 promotor.
Promotor effektivitetsgevinster er især kritisk til transfections, der afhænger af en enkelt integration begivenhed i den korrekte genomisk locus. På grund af vores forbedring af initiativtagerne kørsel resistens Gen-ekspression, er nok modstand protein produceret fra enkelt locus integrationer. En stor bekymring var favorisere af flere integrationer i genomet, når du bruger hygromycin eller G418 som beskrevet. Ingen favorisere af flere integrationer er blevet observeret så langt, som rapporteret tidligere for G418 markeringer med ældre promotor systemer25. Dette betyder, at både hygromycin og G418 er egnede valgbare markører for generation af ren knock-outs og knock-ins. Desværre, valgbar markør blasticidin fungerer ikke på ikke-axenic betingelser. Dette er en større ulempe for vores metode, da blasticidin modstand kassettebånd bruges rutinemæssigt til at generere knock-out konstruktioner i D. discoideum. Konstruktioner, der allerede blev genereret med blasticidin modstand kassetter skal være rederived ved hjælp af en af de anvendelige valgbare markører. En anden mulighed for at overvinde denne begrænsning er at kombinere den nyligt etablerede axenic D. discoideum CRISPR teknologi med denne Transfektion protokol26. Generation af egnet, enkelt guide RNA’er (sgRNAs) er enklere og hurtigere end genopbygningen af komplet knock-out konstruktioner. For fremtidige retninger, mulighed for at generere flere knock-outs ved hjælp af CRISPR/Cas9 kombineret med protokollens Transfektion er tiltalende og kan bane vejen for mange forskere i Fællesskabets Dictyostelium . Dog bør gennemførligheden af de etablerede forbigående ekspressionssystem anvendes til CRISPR/Cas9 i axenic dyrkede celler undersøges nøje.
Act5 banke-in system præsenteret tilbyder en pålidelig og sikker integrationssystem for generation af stabil cellelinjer i D. discoideum, med fordelen, at lignende sider etableret i andre organismer22. Det også afhænger af en enkelt integration begivenhed i genomet og tilbyder mange muligheder for forskellige retninger. Act5 promotor er stærkt aktiv og garanterer næsten homogent udtryk27 uafhængige af dyrkning betingelser. Fluorescerende reporter proteiner kan nemt integreres i dette fristed locus ved hjælp af de manipuleret målretning plasmider. Dette kan være nyttigt, for eksempel til celle-sporing formål, som vist her i en mix eksperiment. Cellerne Vis minimal celle til celle udtryk variabilitet, som kan hjælpe med automatiseret celle sporing. Vigtigere, vises indsættelsen af en ønsket rækkefølge i den handle5 locus fænotype neutral28,29. Som udtrykket ikke afhænger af en valgbar markør til at opretholde protein udtryk, som det ses i tilfældig integrants eller extrachromosomal vektor-bærende cellelinjer, kan act5 system være nyttige for redning eksperimenter, så godt. Da cellelinjer er homogen, kan alle celler analyseres. Det er ikke muligt ved hjælp af en extrachromosomal plasmid for udtryk, hvor der er stor heterogenitet i udtryk.
Ud over disse generelle forbedringer for alle stammer giver evne til at bruge ikke-axenic wild-type celler for Molekylær forskning en vurdering af virkningerne af akkumulerede mutationer i nuværende laboratorium stammer. Flere genetiske rearrangementer er blevet fundet siden vedtagelsen af Ax2 stamme i 1970, som det fremgår af tidligere udgivne microarray analyser26. Syntetisk fænotyper overholdes på grund af tilstedeværelsen af disse mutationer. For eksempel viser en rapporteret phg2 mutant nedsat adhæsion i ét laboratorium stamme baggrund og øget friktion i en anden3. Disse modstridende data kan nu løses ved at gentage forsøget i den fælles forfader stamme (i dette tilfælde, DdB). Styrken af denne tilgang har for nylig vist sig for den lille GTPase RasS30,31.
Evnen til at udføre genetiske eksperimenter i enhver D. discoideum stamme udvider potentiale af nye forskning retninger, der afhænger af brugen af vilde isolater, især dem der involverer social evolution, kin anerkendelse og seksuel cyklus22.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Kay lab for input til denne metode og LMB mikroskopi og flow flowcytometri faciliteter for fremragende videnskabelig og teknisk støtte. Dette arbejde blev finansieret af Medical Research Council grant MC_U105115237 til R. R. Kay, BBSRC (bioteknologi og biologiske Sciences Research Council) tilskud BB/K009699/1 til R. R. Kay, Cancer Research UK give A15672 til R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867, Z, 16/Z til Jonathan R Chubb og MRC finansiering (MC_U12266B) til MRC LMCB Universitet enhed på UCL.
Equipment | |||
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R | ThermoScientific | 05-400-002 | |
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor | ThermoScientific | 12823252 | |
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers | Sigma Aldrich | EP6331000025 | |
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules | BioRad | 1652660 | |
Safety Cabinet Foruna – SCANLAF | Labogene | ||
BioPhotometer Plus | Eppendorf | ||
CLSM 710 | Zeiss | ||
Media & Agaroses | |||
LoFlo Medium | Formedium | LF0501 | |
Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | |
Low EEO Agarose | BioGene | 300-200 | |
Purified Agar | Oxoid | LP0028 | |
SM broth | Formedium | SMB0102 | |
2x LB broth | Formedium | LBD0102 | |
Chemicals | |||
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoScientific | S33102 | |
1 Kb Plus DNA Ladder | ThermoScientific | 10787018 | |
1 Kb DNA Ladder | NEB | N3232L | |
HEPES free acid | Sigma Aldrich/Merck | 391340 EMD | |
KH2PO4 | VWR | P/4800/53 | |
Na2HPO4 * 2 H2O | VWR | 10028-24-7 | |
MgCl2 * 6 H2O | Sigma Aldrich/Merck | 5982 EMD | |
CaCl2 * 2 H2O | Sigma Aldrich | 442909 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876 | |
KOH | VWR | 26668.263 | |
Cultur Dishes | |||
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3595 | |
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3516 | |
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 353003 | |
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 | MatTek Corporation | P50G-1.5-30-F | |
Antibiotics | |||
Geneticin G418-sulphate | Gibco by Life Technologies | 11811-023 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
Additional Consumables | |||
2mm gap electroporation cuvettes, long electrode | Geneflow Limited | E6-0062 | |
10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L | ThermoScientific | 129399 | |
Spreader, L-shaped, sterile | greiner bio-one | 730190 | |
Combitips advanced 5 ml | Eppendorf BIOPUR | 30089669 | |
Kits | |||
ZR Plasmid Miniprep Classic | Zymoresearch | D4016 | |
Quick DNA Miniprep Kit | Zymoresearch | D3025 | |
Zymoclean DNA Recovery Kit | Zymoresearch | D40002 | |
Enzymes | |||
Restriction enzymes | NEB | ||
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | TakaraBio | R045A |