Dictyostelium discoideum 셀 마이그레이션, endocytosis, 개발 등 복잡 한 세포질 과정을 공부 하는 인기 모델 생물 이다. 생물의 유틸리티 유전자 조작의 가능성에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 transfect Dictyostelium discoideum 세포를 액체 매체에서 자란 셀의 기존 한계를 극복 하는 방법을 제시.
Dictyostelium discoideum 개발, 세포 신호, 및 다른 중요 한 세포 생물학 질문 중 세포 분화 과정의 연구에 대 한 흥미로운 모델 유기 체 이다. Dictyostelium 세포를 유전자 조작에 사용할 수 있는 기술 개발은. Transfections는 다른 선택 가능한 마커 및 마커 다시 사이클링, 동종 재결합 하 고 insertional mutagenesis 포함을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 잘 주석 게놈에 의해 지원 됩니다. 그러나, 이러한 접근 axenic 셀 라인 액체 문화에서 성장에 대 한 최적화 하 고 박테리아에만 먹이 비 axenic 야생-타입 셀에 적용 하기 어려운. Axenic 긴장에 있는 변이 Ras 신호, 수 유에 필요한 과도 한 macropinocytosis를 일으키는 방해 하 고 손상 세포 마이그레이션, 신호 변환 및 그 변종에 chemotaxis 실험의 해석을 혼동 한다. 이전 비 axenic 세포를 유전자 조작 하려고 효율과 필요한 복잡 한 실험 절차 부족 했습니다. 우리는 처음으로 이러한 한계를 극복 하는 간단한 transfection 프로토콜을 개발 했습니다. Dictyostelium 분자 유전학에 큰 개선의 그 시리즈 야생-타입 표준 실험실 긴장으로 쉽게 조작할 수를 셀 수 있습니다. 손상 되지 않은 신호 및 운동 성 프로세스를 공부에 대 한 장점 이외에 macropinocytosis 기반 성장 방해 돌연변이 이제 쉽게 격리 수 있습니다. 또한, 전체 transfection 워크플로 크게 가속, 일 보다는 오히려 주에 생성 될 수 있는 재조합 세포. 또 다른 장점은 분자 유전학 더 갓 격리 된 야생-타입 Dictyostelium 샘플 환경에서 수행할 수 있습니다. 이 연구 분야에서 사용 하는 방법의 범위를 확장 시킬 수 있습니다.
Dictyostelium 속은 주로 박테리아에 피드 토양 생활 사회 아메바. 문 Amoebozoa에에서 배치 되 고, 많은 종 고립 되어가 4 개의 다른 clades1로 그룹화 할 수 있습니다. 종 Dictyostelium discoideum (D. discoideum) 먹어서 셀 마이그레이션 등 복잡 한 세포질 과정을 공부 하는 인기 모델 유기 체 되고있다. 제어 하 고 표준화 실험 조건, 박테리아2의 부재에 복잡 하거나 정의 된 액체 매체에서 성장할 수 있다 axenic 셀 라인 개발 되었습니다. 특별 한 중요성의 Ax2, Ax3, 그리고 Ax4 종자를 모두 1970 년대에 생성 된 단일 야생에서 궁극적으로 파생 된 격리 NC43. 유전 공학에 대 한 도구는 결과 19874,5에서 첫 번째 게시 된 녹아웃에이 axenic 긴장에서 개발 되었다. 프로토콜 추가 개발 하 고 axenic 조건6,7에서 사용 하기 위해 최적화 되었다.
적응 야생-타입 디 discoideum 에 이러한 프로토콜 변종 액체 국물에서 성장할 수 있는 여러 실험실에 의해 시도 되었습니다. 그러나이 되지 완전히 성공적인 transfection 프로토콜 복잡 한 박테리아의 용량 선택 시 약8,9에 대 한 싱크 역할을 때문에 효율성 부족 때문. 그 결과, D. discoideum 에 기본적으로 모든 분자 데이터 단일 야생-타입 분리의 자손에서 온다. 우리가이 한계를 극복 하 고 유전자 액체 매체에서 성장 하는 그들의 능력의 독립적인 D. discoideum 셀을 수정 하는 방법을 개발 싶 었 어 요. 그러한 방법에 대 한 필요 axenic 확장할 수 변이 주로 중립 이었던 과거에 생각 했다을 세포 생리학을 손상 하지 않았다 관찰 설명할 수 있습니다. 이 가정은 단지 부분적으로 정확. 일반적으로, 거기 두 가지 주목할 만한 차이점이; 첫째, 다른 사이 고립 된 axenic 긴장, 및 두 번째 때 이러한 axenic 변종 비 axenic 야생 격리8,9와 비교 됩니다.
아마도 가장 중요 한 요소가 이다 주요 axenic 유전자, 도끼B, RasGAP n f 1로 최근 확인 했다. Ras 활동3를 억제 하는 RasGAP으로 n f 1의 주요 기능이입니다. 모든 axenic 긴장에서 효소의 삭제 큰 활성 Ras 패치 형성으로 서 각 성 하는 과도 한 Ras 활동 이끌어 낸다. 이러한 확대 Ras 패치 원형질 막에 PIP3의 축적으로 이어질. PIP3 및 활성 Ras의 동시적인 나타나는 패치는 결국 닫히고 macropinosomes10의 형성에 이르게 하는 원형 주름의 형성에 대 한 서식 파일. 결과는 macropinocytic 활동에 과도 한 증가 이다. Macropinocytosis는 말라 기반 프로세스입니다. Macropinosomes 또는 pseudopods의 형성에 대 한 cytoskeletal 구성 요소에 대 한 경쟁 결과입니다. 셀 행동에 미치는 영향 folate11식물 세포의 chemotaxis의 거의 완전 한 예방에 반영 됩니다. 대규모 확대 PIP3 패치는 아주 영구 있습니다. 굶 어 셀 에서도 PIP3 패치 남아 있으며 pseudopods, 캠프 chemotaxis에 대 한 연구를 해석 하는 문제가 발생할 수 있습니다으로 잘못 해석 될 수 있다.
경우에 따라 n f 1 돌연변이 실험적으로 유용 합니다. 이것은 우리가 bacterially 성장된 디 discoideum transfection 방법 개발에 대 한 두 번째 동기 부여 세포, axenic 세포 macropinocytosis 속도 있는 증가 게 유용한이 과정12의 근본적인 측면을 조사 하 고 이후 . 그러나, macropinocytosis, Ras 및 PI3 kinases10, 등에 필요한 유전자에 있는 돌연변이 박테리아에 성장을 통해 이러한 세포를 조작 하는 데 필요한 그것을 만드는 axenic 성장을 폐지 거의 있다. 귀중 한 박테리아 기반 transfections를 렌더링 하는 또 다른 이유는 멀티 cellularity13,14, 친척 인식15,16, 진화에서 질문을 탐구 하는 Dictyostelids의 사용 증가 그리고 주로 갓 격리 된 야생-타입의 사용에 의존 하는 타 적인 세포 행동 격리17. 모든 연구 분야는 비 axenic 액체 국물에서 성장 하지 않습니다 야생 격리의 유전자 조작에 대 한 효율적인 방법으로 촉진 될 수 있다 언급 했다.
우리의 프로토콜 설명된 한계의 극복을 위한 수 있습니다. 합쳐, 그것으로 인해 선택 과정의 단지 증가 속도 빠릅니다 경우에 디 discoideum 셀 보유 혜택 모든 Dictyostelium 연구원, 대 한 성장 하는 박테리아와 유전자 조작의 가능성 axenic 미디어 (10 h)에 시간을 두 배로 성장에 비해 박테리아에 아메바 (4 h 배로 시간)의 성장.
비 axenic, 야생-타입 Dictyostelium 세포를 사용 하 여 분자 연구에 지금까지 매우 제한 되었습니다. 이러한 긴장의 유전 공학에 대 한 사용할 수 있는 방법을 신뢰성과 효율23, 그들의 일반적인 채용 방지 부족 있다. 액체 매체에서 성장 능력의 독립적인 어떤 디 discoideum 긴장에 대 한 생성 된 자료와 여기에 제시 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그것은이 프로토콜 NC4 파생 셀 라인에 대 한 최적화는 언급 되어야 합니다. 우리가 전에 관찰 하 고 V12M2 및 WS21628,9여기에 표시 됩니다 야생에서 갓 고립 된 긴장에 대 한 transfection 효율 NC4에서 다. Electroporation 조건 특히 transfection 효율성에 상당한 영향을 미칠 것이 고 약간 긴장에 대 한 최적화 더 필요할 수 있습니다. 일반적으로, transfectants의 충분 한 양은 보여주는이 메서드는 실행할 수 있는 지금까지 테스트 모든 긴장에서 관찰 되었습니다. 긍정적인 transfectants NC4 파생 된 종자를 사용 하 여 얻을 수 다른 비 axenic 야생-타입 긴장 하지만 모든 경우에 비해 높은, transfectants의 충분 한 숫자 추가 실험에 대 한 있도록 얻습니다. 플러스, 우리의 프로토콜의 단순은 이전 시도8,9에 비해 주요 개선 이다.
이러한 새로운 비-axenic 프로토콜 모든 표준 유전 절차를 커버 하 고 transfections 수 있습니다 신속 하 고 효율적으로 동시에 수행할 수 있기 때문에 더 이점은 추가 합니다. 긍정적인 복제품은 성장 박테리아 반쪽에 사단 시간 이후 주, 보다는 오히려 일에 얻어질 수 있다. 새로 설립된 된 플라스 미드는 또한 axenic 조건 하에서 작동 하 고 수 있습니다 일상적으로 사용 모두 성장 조건 하에서이 methology22의 또 다른 발전은. 프로토콜에 도입, 플라스 미드 박테리아에 선택에 사용 되는 transfection의 성공에 대 한 중요 한 특별 한 요구 사항이 있다. 특히, 식 및 저항 카세트를 운전 하는 발기인은 성공적인 transfection 중요 합니다. 구동 저항 또는 식 카세트 자주 사용된 act6 (걸 6) 발기인24 세포는 박테리아에 성장 될 때 효율성을 결여 된다. 플라스 미드 시스템에서 높은 활성 act15 (말라 15) 발기인 드라이브 모든 식 카세트, 저항 카세트 coA (coactosin A) 발기인, 모두는 axenic 조건 및 활성의 통제는 성장 박테리아에 셀입니다. 노크에 뿐만 아니라 리포터의 표현에 대 한 요구 사항을 생성 하 고 노크 아웃 구문 그것 우리의 플라스 미드 레 퍼 토리를 사용 해야 하지만 불행히도 이미 만든 비효율적인 act6 발기인을 사용 하는 벡터의 사용을 제한.
모터 효율성은 정확한 genomic 소재 시에 단일 통합 이벤트에 의존 하는 transfections에 대 한 특히 중요 합니다. 저항 유전자 발현을 운전 하는 발기인의 우리의 개선으로 인해 충분 한 저항 단백질 단일 로커 스 통합에서 생산 됩니다. 주요 관심사 때 hygromycin 또는 G418 설명 된 대로 사용 하 여 게놈에 여러 통합의 선호 했다. 여러 통합의 애 용 관찰 되었습니다 지금까지 이전 G418 선택 이전 발기인 시스템25를 사용 하 여에 대 한 보고. 즉 모두 hygromycin G418 있으며 적당 한 선택 가능한 마커 깨끗 한 노크-아웃 및 노크 기능 생성에 대 한 불행히도, 선택 가능한 마커 blasticidin axenic 비 조건에서 작동 하지 않습니다. 이것은 우리의 방법의 주요 불리 blasticidin 저항 카세트는 정기적으로 디 discoideum에 노크 아웃 구문을 생성 하는 데 사용 됩니다. Blasticidin 저항 카세트와 이미 생성 된 구문을 실행할 수 있는 선택 가능한 마커 중 하나를 사용 하 여 rederived 될 필요 합니다. 이 제한을 극복 하기 위해 또 다른 가능성은 최근에 설립 된 axenic D. discoideum CRISPR 결합이 transfection 프로토콜26기술. 적당 한, 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 생성은 간단 하 고 완전 한 노크 아웃 구문의 재건 보다 빠르게. 미래 방향, 가능성에 대 한 다중 노크 아웃 생성의 CRISPR/Cas9 결합이 transfection 프로토콜을 사용 하 여 매력적 이며 Dictyostelium 지역 사회에서 많은 연구원을 위한 길을 닦은 수 있습니다. 그러나, CRISPR/Cas9 axenic 재배 셀에 사용 되는 설립된 과도 식 시스템의 가공은 신중 하 게 시험 되어야 한다.
시스템에서 노크 act5 제시 유사 사이트에 다른 유기 체22설립의 D. discoideum 에서 안정적인 셀 라인의 세대에 대 한 안정적이 고 안전한 통합 시스템을 제공 합니다. 그것은 또한 그리고 게놈에 있는 단일 통합 이벤트에 따라 다른 연구 방향에 대 한 많은 가능성을 제공 합니다. Act5 발기인 강력 하 게 활성화 하 고 거의 균일 식27 재배 조건의 독립 보장. 형광 기자 단백질 설계 대상 플라스 미드를 사용 하 여이 안전한 피난처 로커 스에 쉽게 통합 될 수 있습니다. 이 유용할 수 있습니다, 예를 들어 셀 추적 목적을 위해 혼합 실험에서 그림과 같이. 셀 표시 최소 셀 식 가변성, 추적 하는 자동화 된 셀에는 도움을 줄 수 있습니다. 중요 한 것은, 5 행동궤적으로 원하는 시퀀스의 삽입 phenotypically 중립28,29나타납니다. 로 식 임의의 integrants 또는 extrachromosomal 벡터 베어링 셀 라인에서 보듯이 단백질 식이 유지 하기 위해 선택 가능한 표식에 의존 하지 않는, act5 시스템 구조 실험을 위해 유용할 수 있습니다. 셀 라인 균질 성 때문에, 모든 세포를 분석할 수 있습니다. 이것에 상당한이 질 식에서 식에 대 한 extrachromosomal 플라스 미드를 사용 하 여 불가능 합니다.
모든 변종에 대 한 이러한 일반적인 개선 뿐만 아니라 분자 연구에 대 한 비 axenic 야생-타입 셀을 사용할 수는 현재 실험실 긴장에 축적 된 돌연변이의 효과의 평가 수 있습니다. 이전에 게시 microarray 분석26여 같이 여러 유전자 재배열 1970 년에, Ax2 스트레인의 채택 이후 발견 되었습니다. 합성 고기 이러한 변이의 존재 때문에 관찰 된다. 예를 들어 보고 phg2 돌연변이 한 실험실 긴장 배경 및 다른3에 증가 접착 줄된 접착을 보여줍니다. 이러한 충돌 데이터 (이 경우, DdB)에서 일반적인 조상 스트레인에 실험을 반복 하 여 이제 해결할 수 있습니다. 이 접근 방법의 강도 최근 작은 GTPase RasS30,31표시 되었습니다.
어떤 디 discoideum 긴장에서 유전자 실험을 수행 하는 능력 특히 그 사회 진화, 킨 인식과 성적 사이클22사건 야생 격리의 사용에 의존 하는 새로운 연구 방향의 잠재력을 확장 합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자가이 방법에 대 한 입력에 대 한 케이 연구소와는 LMB 현미경 흐름 cytometry 시설과 우수한 과학 및 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 의료 연구 위원회 그랜트 MC_U105115237 R. R. 케이, BBSRC (생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회)를 부여 BB/K009699/1 R. R. 케이 의해 투자 되었다, 암 연구 영국 R. H. Insall, Wellcome 신뢰 수석 친목을 A15672 부여 202867/Z/16/Z 조나단 R 첩, 및 MRC UCL에서 MRC LMCB 대학 단위 (MC_U12266B)을 자금.
Equipment | |||
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R | ThermoScientific | 05-400-002 | |
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor | ThermoScientific | 12823252 | |
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers | Sigma Aldrich | EP6331000025 | |
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules | BioRad | 1652660 | |
Safety Cabinet Foruna – SCANLAF | Labogene | ||
BioPhotometer Plus | Eppendorf | ||
CLSM 710 | Zeiss | ||
Media & Agaroses | |||
LoFlo Medium | Formedium | LF0501 | |
Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | |
Low EEO Agarose | BioGene | 300-200 | |
Purified Agar | Oxoid | LP0028 | |
SM broth | Formedium | SMB0102 | |
2x LB broth | Formedium | LBD0102 | |
Chemicals | |||
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoScientific | S33102 | |
1 Kb Plus DNA Ladder | ThermoScientific | 10787018 | |
1 Kb DNA Ladder | NEB | N3232L | |
HEPES free acid | Sigma Aldrich/Merck | 391340 EMD | |
KH2PO4 | VWR | P/4800/53 | |
Na2HPO4 * 2 H2O | VWR | 10028-24-7 | |
MgCl2 * 6 H2O | Sigma Aldrich/Merck | 5982 EMD | |
CaCl2 * 2 H2O | Sigma Aldrich | 442909 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876 | |
KOH | VWR | 26668.263 | |
Cultur Dishes | |||
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3595 | |
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3516 | |
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 353003 | |
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 | MatTek Corporation | P50G-1.5-30-F | |
Antibiotics | |||
Geneticin G418-sulphate | Gibco by Life Technologies | 11811-023 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
Additional Consumables | |||
2mm gap electroporation cuvettes, long electrode | Geneflow Limited | E6-0062 | |
10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L | ThermoScientific | 129399 | |
Spreader, L-shaped, sterile | greiner bio-one | 730190 | |
Combitips advanced 5 ml | Eppendorf BIOPUR | 30089669 | |
Kits | |||
ZR Plasmid Miniprep Classic | Zymoresearch | D4016 | |
Quick DNA Miniprep Kit | Zymoresearch | D3025 | |
Zymoclean DNA Recovery Kit | Zymoresearch | D40002 | |
Enzymes | |||
Restriction enzymes | NEB | ||
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | TakaraBio | R045A |