Dictyostelium discoideum er en populær modell organisme å studere komplekse cellulære prosesser som celle migrasjon, endocytose og utvikling. Nytten av organismen er avhengig av muligheten for genetisk manipulasjon. Her presenterer vi metoder for å transfect Dictyostelium discoideum celler som eksisterende begrensningene av dyrking celler i flytende medier.
Dictyostelium discoideum er en spennende modell organisme for studier av celle differensiering prosesser under utvikling, celle signalisering og andre viktige mobilnettet biologi spørsmål. Teknologien å manipulere genetisk Dictyostelium celler er godt utviklet. Transfections utføres med ulike valgbare markører og markør re sykling, inkludert homologe rekombinasjon og insertional mutagenese. Dette støttes av et godt kommentert genom. Men disse tilnærmingene er optimalisert for axenic cellelinjer vokser i flytende kulturer og er vanskelig å bruke for ikke-axenic vill-type celler, som beiter på bakterier. Den mutasjoner som finnes i axenic stammer forstyrre Ras signalering, forårsaker overdreven macropinocytosis kreves for fôring, og svekke celle migrasjon, som forundrer tolkningen av signaltransduksjon og chemotaxis eksperimenter i disse stammer. Tidligere forsøk på å manipulere genetisk ikke-axenic celler har manglet effektivitet og nødvendige komplekse eksperimentelle prosedyrer. Vi har utviklet en enkel transfection protokoll som, for første gang, overvinner disse begrensningene. Disse rekke store forbedringer Dictyostelium molekylær arvelighetsforskning gjør at vill-type celler kan manipuleres like enkelt som standard laboratorium stammer. I tillegg til fordelene for å studere uskadet signalisering og motilitet prosesser, kan mutanter som forstyrrer macropinocytosis-baserte vekst nå være lett isolert. Videre er hele hva arbeidsflyten betraktelig, med rekombinant celler som kan genereres i dager i stedet for uker. En annen fordel er at molekylær arvelighetsforskning videre kan utføres med fersk isolert vill-type Dictyostelium prøver fra miljøet. Dette kan bidra til å utvide omfanget av tilnærminger brukt i disse forskningsområder.
Dictyostelium slekten er jord-levende sosiale amoeba som hovedsakelig lever bakterier. Plasseres i rekken Amoebozoa, et stort antall arter har vært isolert som kan grupperes i fire forskjellige klader1. Arten Dictyostelium discoideum (D. discoideum) har blitt en populær modell organisme å studere komplekse cellulære prosesser som celle migrasjon og fagocytose. Kontrollere og standardisere eksperimentelle forhold, axenic cellen linjer har blitt utviklet som kan vokse i komplekse eller definert flytende medium i fravær av bakterier2. Av særlig betydning er Ax2, Ax3, Ax4 stammer, som ble alle generert i 1970 og stammer fra en enkelt vill isolere NC43. Verktøy for genetisk engineering ble utviklet i disse axenic stammer, som resulterer i første publiserte knockout i 19874,5. Protokollene ble ytterligere utviklet og optimalisert for bruk under axenic forhold6,7.
Tilpasning av disse protokollene å vill-type D. discoideum stammer som ikke kan vokse i flytende kjøttkraft forsøkt av flere laboratorier. Men har dette ikke blitt fullt vellykket siden transfection protokollene er komplekse og mangler effektivitet delvis på grunn av antall bakterier som vask for selektiv reagenser8,9. Som et resultat, kommer i hovedsak alle molekylære data på D. discoideum fra etterkommere av en enkelt vill-type isolere. Vi ønsket å overkomme denne begrensningen og utvikle en metode for å endre genetisk D. discoideum celler uavhengig av deres evne til å vokse i flytende medium. Behovet for slik metode kan forklares av observasjon at det ble antatt i fortiden som mutasjoner tillater axenic vekst var hovedsakelig nøytrale og ikke svekke celle fysiologi. Denne antagelsen er bare delvis riktig. Generelt finnes det to bemerkelsesverdige forskjeller; først isolerte mellom forskjellige axenic stammer, og andre, når disse axenic stammer sammenlignes med ikke-axenic vill isolerer8,9.
Kanskje er den mest kritiske faktoren viktige axenic genet, øksB, som ble identifisert nylig som RasGAP NF1. NF1 som en RasGAP viktigste funksjon er å hindre Ras aktivitet3. Sletting av enzymet i alle axenic stammer fører til overdreven Ras aktivitet manifestert som dannelsen av store aktive Ras patcher. Disse forstørret Ras-oppdateringene føre til Oppsamling av PIP3 i plasma membranen. De vises tilfeldige flekker av PIP3 og aktive Ras er en mal for dannelsen av en sirkulær krusning som til slutt lukker og fører til dannelse av macropinosomes10. Konsekvensen er overdreven økning i macropinocytic aktivitet. Macropinocytosis er en begrepsordbok-drevet prosess. En konkurranse for cellen cytoskjelett komponenter for dannelsen av macropinosomes eller eukaryotene er resultatet. Dens innvirkning på celle atferd gjenspeiles i den nesten komplette forebygging av chemotaxis av vegetative celler folat11. Svær forstørret PIP3 patcher er meget vedvarende. Selv i starved celler, PIP3 patcher fortsatt og kan feiltolkes som eukaryotene, hvilke kanne anledning problemer tolke studier på chemotaxis til leiren.
I noen tilfeller er NF1 mutasjon eksperimentelt nyttig. Dette fører oss til en andre motivasjon for å utvikle en transfection metode for bacterially vokste D. discoideum celler, siden økningen i macropinocytosis rate gjør axenic celler verdifulle for å undersøke grunnleggende sider ved denne prosessen12 . Imidlertid mutasjon i genene kreves for macropinocytosis, for eksempel Ras- og PI3-kinaser10, har nesten avskaffet axenic vekst, noe som gjør det nødvendig å manipulere disse cellene gjennom vekst på bakterier. En annen grunn som gjengir bakterier-baserte transfections verdifulle er den økende bruken av Dictyostelids å utforske spørsmål i utviklingen av flere cellularity13,14, kin anerkjennelse15,16: og altruistiske mobilnettet atferd, som hovedsakelig avhenger av bruken av fersk isolert vill-type isolerer17. Alle nevnte forskningsområder kan ordnes med effektive metoder for genetisk manipulering av vill isolert, som er ikke-axenic og vokser ikke i flytende kjøttkraft.
Våre protokoller brukes overvinne beskrives begrensningene. Til sammen har muligheten til å utføre genetisk manipulasjon med bakteriell vokst D. discoideum celler har fordeler for alle Dictyostelium forskere, selv om det er bare økte hastigheten på utvelgelsesprosessen grunn raskere veksten av amoeba (4 h dobling tid) på bakterier i forhold til veksten i axenic medier (10 h dobling tid).
Bruk av ikke-axenic, vill-type Dictyostelium celler har vært svært begrenset så langt i molekylær forskning. Metoder for genteknologi av disse stammer har manglet pålitelighet og effektivitet23, hindrer deres generelle adopsjon. Genererte materialer og protokoller presenteres her kan brukes for D. discoideum belastning uavhengig av dens evne til å vokse i flytende medium. Det bør nevnes at denne protokollen er optimalisert for NC4-avledet cellelinjer. Hva effektivitet for fersk isolert stammer fra naturen skiller seg fra NC4, som vi har sett før, og er vist her over for V12M2 og WS21628,9. Electroporation forholdene synes spesielt å ha en betydelig innflytelse på transfection effektivitet og kan kreve ytterligere optimalisering for noen stammer. Generelt, en tilstrekkelig mengde transfectants har blitt observert i alle stammer testet så langt viser at disse metodene er gjennomførbar. Antall positive transfectants får NC4-avledet stammer er høyere enn andre ikke-axenic vill-type stammer, men i alle tilfeller, hentes tilstrekkelig antall transfectants slik at videre studier. Dette, samt enkelheten av våre protokollen, er den store forbedringen i forhold til tidligere forsøk8,9.
Disse nye protokoller for ikke-axenic dekker alle standard genetisk prosedyrer og legge ytterligere fordeler, siden transfections kan utføres raskt og effektivt parallelt. Positiv kloner kan fås i dager i stedet for uker, siden vekst på bakterier halvdeler divisjon tiden. Nyetablerte plasmider også arbeide under axenic forhold og kan rutinemessig brukes under begge vekst betingelsene, som er en annen avansement dette methology22. Som introdusert i protokollen, plasmider brukes til valg på bakterier har spesielle krav som er avgjørende for suksess for transfection. Spesielt er arrangørene kjøring uttrykk og motstand kassettene viktig for vellykket transfection. De brukte act6 (begrepsordbok 6) promoter24 for kjøring motstand eller uttrykk kassettene mangler effektivitet når celler er dyrket på bakterier. I systemet vårt plasmider kjører svært aktiv act15 (begrepsordbok 15) selskapet alle uttrykk kassetter, mens motstand kassettene er under kontroll av en coA (coactosin A) promoter, som begge er aktiv under axenic forhold og i celler dyrket på bakterier. Krav for uttrykket av reporteren konstruerer og banke i og Bank-out konstruksjoner gjør det nødvendig å bruke plasmider repertoaret, men dessverre begrenser bruken av vektorer allerede opprettet som bruker ineffektiv act6 promoter.
Promotoren effektivitet er spesielt viktig for transfections som en enkelt integrering hendelse i riktig genomisk locus. På grunn av våre forbedring av arrangørene kjøring genuttrykk motstand, produseres nok motstand protein enkelt locus integrasjoner. En stor bekymring var favoriserer av flere integrasjoner i genomet når du bruker hygromycin eller G418 som beskrevet. Ingen favorisering av flere integrasjoner har observert så langt, som rapportert tidligere for G418 valg med eldre promoter systemer25. Dette betyr at både hygromycin og G418 er egnet valgbar markører for generering av ren fortrenging og knock-ins. Dessverre, valgbar markør blasticidin fungerer ikke under ikke-axenic forhold. Dette er en stor ulempe av vår metode, siden blasticidin motstand kassetten er rutinemessig brukes til å generere knock-out konstruksjoner i D. discoideum. Konstruksjoner som var allerede generert med blasticidin motstand kassetter må være rederived med en av gjennomførbar valgbar markører. En annen mulighet å overkomme denne begrensningen er å kombinere de nylig etablerte axenic D. discoideum CRISPR teknologi med denne transfection protokollen26. Generering av egnet, enkelt guide RNAs (sgRNAs) er enklere og raskere enn gjenoppbyggingen av fullført banke ut konstruksjoner. For fremtidige retninger, muligheten til å generere flere fortrenging bruker CRISPR/Cas9 kombinert med denne transfection protokollen er tiltalende og kan bane vei for mange forskere i Dictyostelium samfunnet. Imidlertid bør workability av etablerte forbigående uttrykk brukt for CRISPR/Cas9 i axenic voksen celler bli nøye undersøkt.
Act5 bank i systemet presentert tilbyr en pålitelig og sikker integrering system for generering av stabil cellelinjer i D. discoideum, med fordelen av lignende nettsteder i andre organismer22. Også avhengig av en enkelt integrering hendelse i genomet og tilbyr mange muligheter for forskjellige forsknings-retninger. Act5 selskapet er sterkt aktiv og garanterer nesten homogen uttrykk27 uavhengig av dyrking. Fluorescerende reporter proteiner kan enkelt integreres i denne trygg havn locus bruker utviklet målretting plasmider. Dette kan være nyttig, for eksempel for celle-sporing formål, som vist her i en blanding eksperiment. Cellene viser minimal celle til celle uttrykk variasjon, som kan hjelpe i automatiserte celle sporing. Viktigere, vises innsetting av en ønsket rekkefølge i handle5 locus svært nøytral28,29. Som uttrykket ikke avhenger på merketråd valgbar å opprettholde protein uttrykk, sett i tilfeldig baneformasjonene eller extrachromosomal vektor-bærende linjer, kan act5 systemet være nyttig for redning eksperimenter, også. Siden cellelinjer homogen, kan alle celler analyseres. Dette er ikke mulig å bruke en extrachromosomal plasmider uttrykk, der det er betydelig heterogenitet i uttrykk.
I tillegg til disse generelle forbedringer for alle stammer gir muligheten til å bruke ikke-axenic vill-type celler for molekylær forskning en vurdering av effektene av akkumulert mutasjoner i gjeldende laboratorium stammer. Flere genetiske rearrangements har blitt funnet siden innføringen av den Ax2 stammen i 1970, som vist av tidligere publiserte microarray analyser26. Syntetisk fenotyper er observert på grunn av disse mutasjonene. For eksempel viser en rapporterte phg2 mutant redusert vedheft i én laboratorium belastning bakgrunn og økt vedheft i en annen3. Slike motstridende data kan nå løses ved å gjenta eksperimentet i felles stamfar belastningen (i dette tilfellet DdB). Styrken i denne tilnærmingen har nylig vist for de små GTPase RasS30,31.
Muligheten til å utføre genetiske eksperimenter i D. discoideum belastning utvider potensialet i nye forsknings-retninger som avhenger av bruken av vill isolert, spesielt de som involverer sosiale utviklingen, kin anerkjennelse og seksuell syklus22.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Kay lab for inngang til denne metoden og LMB mikroskopi og flyt cytometri fasiliteter for utmerket vitenskapelig og teknisk støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Medical Research Council grant MC_U105115237 til R. R. Kay, BBSRC (bioteknologi og Biological Sciences Research Council) grant BB/K009699/1 til R. R. Kay, kreftforskning Storbritannia gi A15672 til R. H. Insall, Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z Jonathan R Chubb og MRC finansiering (MC_U12266B) til MRC LMCB University enheten på UCL.
Equipment | |||
Eppendorf Microcentrifuges 5424/5424R | ThermoScientific | 05-400-002 | |
Eppendorf 5702R Centrifuges with A-4-38 Model Rotor | ThermoScientific | 12823252 | |
Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers | Sigma Aldrich | EP6331000025 | |
Gene Pulser X Cell, including CE & PC modules | BioRad | 1652660 | |
Safety Cabinet Foruna – SCANLAF | Labogene | ||
BioPhotometer Plus | Eppendorf | ||
CLSM 710 | Zeiss | ||
Media & Agaroses | |||
LoFlo Medium | Formedium | LF0501 | |
Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | |
Low EEO Agarose | BioGene | 300-200 | |
Purified Agar | Oxoid | LP0028 | |
SM broth | Formedium | SMB0102 | |
2x LB broth | Formedium | LBD0102 | |
Chemicals | |||
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoScientific | S33102 | |
1 Kb Plus DNA Ladder | ThermoScientific | 10787018 | |
1 Kb DNA Ladder | NEB | N3232L | |
HEPES free acid | Sigma Aldrich/Merck | 391340 EMD | |
KH2PO4 | VWR | P/4800/53 | |
Na2HPO4 * 2 H2O | VWR | 10028-24-7 | |
MgCl2 * 6 H2O | Sigma Aldrich/Merck | 5982 EMD | |
CaCl2 * 2 H2O | Sigma Aldrich | 442909 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876 | |
KOH | VWR | 26668.263 | |
Cultur Dishes | |||
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Low Evaporation Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3595 | |
6 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 3516 | |
100 x 20 mm style Tissue Culture Dish, Tissue Culture Treated | Corning Incorporated | 353003 | |
50 mm Glass Bottom Microwell Dishes No1.5 | MatTek Corporation | P50G-1.5-30-F | |
Antibiotics | |||
Geneticin G418-sulphate | Gibco by Life Technologies | 11811-023 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
Additional Consumables | |||
2mm gap electroporation cuvettes, long electrode | Geneflow Limited | E6-0062 | |
10 µl Inoculating Loop, Blue 10 Micro L | ThermoScientific | 129399 | |
Spreader, L-shaped, sterile | greiner bio-one | 730190 | |
Combitips advanced 5 ml | Eppendorf BIOPUR | 30089669 | |
Kits | |||
ZR Plasmid Miniprep Classic | Zymoresearch | D4016 | |
Quick DNA Miniprep Kit | Zymoresearch | D3025 | |
Zymoclean DNA Recovery Kit | Zymoresearch | D40002 | |
Enzymes | |||
Restriction enzymes | NEB | ||
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | TakaraBio | R045A |