Her introducerer vi en metode til at bruge et intra-ventrikel optisk kateter i perfvant hjerter til at udføre absorbans spektroskopi på tværs af hjertevæggen. De indhentede data giver solide oplysninger om vævs iltspændinger samt substrat udnyttelse og membran potentiale samtidig med hjerte præstations foranstaltninger i denne allestedsnærværende forberedelse.
Absorbans spektroskopi af hjertemusklen giver ikke-destruktiv vurdering af cytosolisk og mitokondrie iltning via myoglobin og cytochrom absorbans hhv. Desuden, talrige aspekter af mitokondrie metaboliske status såsom membran potentiale og substrat indgang kan også estimeres. For at udføre hjertevægtransmission optisk spektroskopi, er et kommercielt tilgængeligt side fyring optisk fiber kateter placeret i venstre ventrikel af det isolerede perfileret hjerte som en lyskilde. Lys passerer gennem hjertet væggen er indsamlet med en ekstern optisk fiber til at udføre optisk spektroskopi af hjertet i nær realtid. Transmissions metoden undgår talrige overflade sprednings forstyrrelser, der forekommer i udbredte refleksions tilgange. Ændringer i transmural absorbans Spectra blev devolveret ved hjælp af et bibliotek af kromophore reference spektre, der giver kvantitative målinger af alle de kendte kardiale chromophorer samtidigt. Denne spektral dekoncentreringsmetoder eliminerede iboende fejl, der kan skyldes brug af almindeligt dobbelte bølgelængde metoder anvendes til overlappende absorbans Spectra, samt forudsat en kvantitativ vurdering af godhed af pasform. Et brugerdefineret program var designet til dataindsamling og analyse, som tillod investigator at overvåge den metaboliske tilstand af præparatet under forsøget. Disse relativt enkle Tilføjelser til standarden hjerte perfusion system giver en unik indsigt i den metaboliske tilstand af hjertevæggen ud over konventionelle foranstaltninger af sammentrækning, perfusion, og substrat/ilt udvinding.
Optisk absorbans spektroskopi til overvågning af intakt organ biokemi er en bredt anvendt tilgang på grund af dens iboende, ikke-destruktiv natur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin absorbans giver et mål for den gennemsnitlige cytosolisk oxygen spænding10,11,12. Mitokondrie cytokromer der giver oplysninger om substrat indgang på niveau med flavins, membran potentiale fra cytochrom bL: bH13, og ilt levering til mitokondrier i cellen fra cytochrom oxidase (Cox ) redox State14. Glancy et al. påvist, at aktiviteterne i de enkelte komplekser kan bestemmes ved at måle mitokondriel membranpotentialet og metaboliseringsraten15. Derfor, ved hjælp af optisk spektroskopi, et væld af oplysninger kan opnås uden behov for eksogene sonder eller større ændringer af nuværende studie systemer. Formålet med dette papir er at fremlægge en robust metode til opsamling af transmissions optiske spektre i konventionelle perfetat hjerte præparater med den eneste større modifikation, der udfører undersøgelser i et mørkt miljø.
Refleksions absorptions spektroskopi er med held blevet anvendt til at udføre optisk spektroskopi af perfbrugt Heart3,6,16,17,18,19 samt som hjertet i vivo1. Refleksions spektroskopi består af at hæmme lyset på hjertets overflade og samle lyset spredt gennem hjertet samt diffus og spejlvendt lys. Således, det indsamlede lys i denne tilgang er en sammensat af flere spredning mekanismer samt vævet kromoforholdig abscisse af interesse. På grund af bevægelse og komplekse overflade af hjertet, lyset refleksion fra overfladen af hjertet er særligt problematisk, ændre dybden af penetration og mængden af rent reflekteret lys.
Begrænsningerne af refleksions absorption spektroskopi præsenteret ovenfor blev løst ved at indføre et optisk kateter i venstre ventrikel hulrum, tillader indsamling af transmitteres lys på tværs af venstre ventrikel fri væg20. Fordelene ved transmission spektroskopi for denne type undersøgelse blev værdsat i tidlige invasive undersøgelser af Tamura et al.9 den nuværende gennemførelse giver en meget robust transmission absorption spektroskopi analyse af det intakte hjerte med med hensyn til cytosolisk iltning og mitokondrier redox tilstand under en række betingelser21. Disse indledende undersøgelser brugte et specielt fabrikeret kateter med en drevet LED på spidsen orienteret til at generere en side-fyring mønster af hvidt lys gennem myokardiet. Men det relativt store LED tippet kateter er kun egnet til brug på medium størrelse hjerter (kanin, marsvin, etc.) og krævede brugerdefinerede fabrikation. I den nuværende undersøgelse, en metode til at bruge en kommercielt tilgængelige 200-micron kerne side-fyring optisk fiber som en lys guide er præsenteret. I stedet for en kablet LED på spidsen, kateteret med 500-mikro spids omdirigerer lys fra en ekstern kilde øge alsidigheden af systemet. Denne fremgangsmåde gør det muligt at anvende en lang række eksterne lyskilder, herunder lasere til applikationer såsom Raman spredning spektroskopi. For at kvantificere disse data præsenteres en online fuld multikomponent spektralanalyse med kendt reference spektre for at forbedre nøjagtigheden af den spektroskopiske bestemmelse af hjertets kromophorer som tidligere beskrevet20,22. Kildekoden til denne analyse vil blive leveret af forfatterne efter anmodning. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, oplysninger om kardiel biokemi og mitokondrie funktion kan opnås samtidig med de konventionelle hjerte funktionelle parametre med ringe eller ingen indvirkning på hjertet forberedelse. Da hjertet er kritisk afhængig af mitokondrie funktion og ilttilførsel, vil denne tekniske tilføjelse til det klassiske perfaralt hjerte system i høj grad forbedre fortolkningen og nytten af denne vigtige model af hjertets ydeevne.
Den isolerede tilbage eller arbejder perfektioneres hjerte forberedelse er en grundpille i studiet af hjertets fysiologi samt den prækliniske undersøgelse af teknikker og lægemidler på hjertet. Nøglen til dens anvendelse har været den lette forberedelse, robuste funktionelle egenskaber og kontrol af eksperimentelle parametre samt evnen til at måle mange funktionelle parametre i det bankende hjerte. Optisk absorbans spektroskopi giver indsigt i vævs oxygenering samt mitokondrier metaboliske aktiviteter. Optisk spektroskopi har primært udført i de isolerede perfbrugte hjerteundersøgelser i refleksions tilstand, at det er vanskeligt at fortolke på grund af bevægelse og let spredning komplikationer.
Vi har introduceret ventrikel væg transmission optisk spektroskopi (VWTOS) at give en robust metode til overvågning af hjertevæv metaboliske chromophores. I en tidligere publikation viste vi, at en LED-hardwired til spidsen af koaksialkablet20 gør en unik intrakardiel side-fyring lyskilde, der kan bruges til vwtos perfbrugte hjerter. Den side-fyring refererer til projektion af lys vinkelret på den lange akse af kateteret, ideel til belysning af ventrikel fri væg. LED kateteret var lille nok til ikke at påvirke hjertets funktion, men krævede specialiseret fabrikation i laboratoriet. Den nuværende undersøgelse præsenterer brugen af en 500 micron kommerciel side fyring kateter, der kan kobles til enhver lyskilde kompatibel med fiberoptik. Disse side-fyring optiske katetre blev kommercielt udviklet til laser ablation vinkelret på den lange akse af fiber. Naturligvis bruger vi lys strøm meget lavere end nødvendigt for photoablation. Mindre fibre er tilgængelige til brug på mindre præparater som den perfuse mus hjerte27. Dette fiberoptiske system leverede tilstrækkelig belysning gennem hjertevæggen i bølgelængdeområdet, hvor hjertechromophorer absorberer (450 – 630 nm). Ved hjælp af en pickup fiberoptik på yderside af hjertet, kan absorbans af myoglobin og mitokondrier cytokromer der overvåges med fremragende tidsmæssig og spektral opløsning (Se figur 5). Den side-fyring fiberoptisk tilgang har flere fordele i forhold til LED kateter for VWTOS, herunder en meget mindre tværsnits profil af kateteret, der minimerer virkningen af kateteret på hjertet, mere fleksibel reducere virkningen på hjerteklap og ventrikel præstation, ingen elektriske forbindelser, der kan kort ud i saltopløsning perfusate, og endelig et kateter, der bruger en ekstern lyskilde, der øger fleksibiliteten af lyskilde valg for VWTOS.
På grund af den stærke absorbans af hjertet under 490 nm, er det vanskeligt at generere meget information om soret båndet af cytokromer der i regionen 410-445 nm eller NADH ved 340 nm. Således er den brede absorbans af FAD ved 450 Nm den laveste frekvens absorbans, der observeres, selv om hele absorptions toppen af dette kromophorer ikke er afprøvet. Ved hjælp af VWTOS signal til støjforhold er meget høj, da hele væggen er udtaget i modsætning til overflade refleksion spektroskopi, almindeligvis anvendes20, som kun prøver overfladen af hjertet med talrige spredning spørgsmål. VWTOS prøveudtagning hele hjertevæggen er mere analog med nuklear magnetisk Resonansspektroskopi (NMRS) målinger af mange hjerte metabolitter såsom 31P detekteret adenosintrifosfat og kreatinphosphat28, 13C påvist mærket metabolitter29,30 inklusive hyperpolariserede etiketter31,32og 1t detekterede metabolitter33. Da VWTOS kan udføres ved hjælp af ikke-magnetiske anordninger, er det helt muligt, at NMR og VWTOS kan udføres samtidigt. VWTOS er ikke begrænset til endogene chromophorer og kan bruges til at overvåge absorption fra optiske sonder for pH, ca2 +og plasma membran potentiale.
Vi bruger 2 Hz (dvs. 2 prøver/sekund), som giver fremragende enkelt spektrum signal til støj. Selv om højere prøveudtagnings rater kan opnås, der tillader kardiel cyklus analyse, tidligere undersøgelser har vist, at der er ingen Beat at slå variation i kromophore absorbans, så ingen indsats for selektivt at indsamle lys som en funktion af hjerte cyklus var lavet34. På grund af VWTOS geometri er påvisning af lys mindre afhængig af vævs bevægelse end refleksions metoder, da de komplekse overflade sprednings hændelser elimineres. Vi finder, at svær bevægelse kan forstyrre disse foranstaltninger, men realtid spektralanalyse afslører hurtigt spektral overgange uoverensstemmende med vævs kromophore overgange. Igen, dette sker kun, når hjertet bevæger sig groft væk fra indsamlingen fiber dramatisk reducere mængden af indsamlede transmitterede lys.
Vwtos-data analyseres ved hjælp af fuld spektral tilpasnings rutine baseret på et reference bibliotek af spektre af hjertechromophorer og lyskildens spektrum som tidligere beskrevet20,22,27, 35 med en simpel lineær mindste kvadraters tilgang. Denne spektral monteringsprocedure kompenserede for overlappende absorbans spektrum og er ikke afhængig af “isobestiske” bølgelængder. Denne komplette spektrum analyse eliminerer artefakter forbundet med fælles dobbeltstråle (dvs. to bølgelængde) analyse1,3,6 , som har vist sig at være problematisk20. Den ekstra fordel ved fuld spektralanalyse er genereringen af en godhed af pasform fra residualerne, ikke tilgængelig i Dual Beam protokoller.
I denne undersøgelse fokuserede vi på virkningen af cyanid på hjertets optiske egenskaber. Som cyanid blokke cytochrom oxidase, det hæmmer iltforbrug og hovedsagelig resulterer i en nettoreduktion af alle de cytochromer som elektroner tilbage op i Cytochrom kæden. Men membranpotentialet tilsyneladende fortsat høj, da redox ændringer i bL og bH er meget små sammenlignet med cytochrom c13. Med ophør af iltforbrug bør iltspændingen i vævet nærme sig perfusatet, og vi bemærkede en tidlig stigning i oxygeneret myoglobin med cyanid i overensstemmelse med forestillingen om, at det saltholdige perfoerede hjerte, selv i retrograd perfusion tilstande, er ikke fuldt oxygenerende myoglobin i cytosol19,20,21,36. Sammenligning af den maksimale effekt af cyanid på oxygeneret myoglobin med det fuldt deoxygenerede spektrum opnået med iskæmi afslører en myoglobin iltning på kun omkring 88%, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser.
Det er vigtigt at bemærke i denne undersøgelse, at cyanid virkningerne på myoglobin iltning og cytochrom reduktion blev tidsmæssigt løst. Det er overraskende, at virkningerne af cyanid blev først observeret på koronar flow og myoglobin før store ændringer i hjertets cytokromer der redox tilstand blev observeret. Den tidlige markante stigning i strømmen tyder på, at en effekt på arteriel glat muskulatur24,37 kan forekomme, før der observeres grove metaboliske virkninger i hjerte cellerne. Stigningen i flow, potentielt med en beskeden cyanid induceret fald i respiration, sandsynligvis resulterer i den umiddelbare stigning i oxygeneret myoglobin forårsaget af stigningen i ilt levering. Med udbredelsen af cyanid hæmning til myocytterne observeres en yderligere stigning i koronar strømmen (Se regionen markeret 3 i figur 5a), sandsynligvis drevet af talrige metaboliske faktorer38. Den store tidlige virkning af cyanid på flow tyder på, at metabolismen af den vaskulære glatte muskulatur kan være mere potent i at ændre vaskulær tone end metabolismen af myocytterne. Disse data understøtter den veletablerede forestilling om, at myoglobin har en meget lavere affinitet for ilt end Cox, selv i det intakte hjerte, da myoglobin iltning forekom godt før ændringer i mitokondrien redox-tilstand (figur 5). Dette høje niveau af deoxygeneret myoglobin under kontrolforhold er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der tyder på, at det isolerede saltvands perfokat hjerte kan være delvist hypoxisk selv under kontrolbetingelser9,19, 20,21,27,36, understreger vigtigheden af at overvåge hjertevæv iltning, når du bruger denne vigtige model i hjertets fysiologi.
Vi præsenterer her de eksperimentelle detaljer for at gennemføre transmission absorption spektroskopi på den isolerede perfektioneres hjerte. Vi har med succes tilpasset denne teknik til brug på hjerterne fra kanin til mus ved hjælp af en tynd side-fyring intrakardiel optisk fiber. Udnytte State of the art fuld spektral montering rutiner, den komplekse optiske interaktion af hjertets kromoforer kan let udvindes giver, en nær real-time måling af kritiske elementer af Myokardie metabolisme samtidig med konventionelle funktionelle foranstaltninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev fuldt understøttet af NHLBI murene program (projekt # ZIA HL00460131).
BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |